乌苏里蝮蛇丝氨酸蛋白酶基因克隆和序列分析

目的:构建乌苏里蝮蛇(Gloydius ussuriensis)毒腺c DNA文库,克隆、分析丝氨酸蛋白酶基因,为进一步基因研究和操作奠定基础。方法:采用链转化法和长距离PCR技术,构建乌苏里蝮蛇毒腺c DNA文库。用TRIzol试剂盒从乌苏里蝮蛇毒腺提取总RNA,再用Oligo(d T) -生物素-链菌素-磁珠法从总RNA中分离m RNA ,反转录合成c DNA第一链,长距离PCR合成第二链c DNA。回收c DNA,用限制性内切酶消化产生粘性末端,层析去除小于5 0 0 bp片段,纯化的c DNA插入载体p Bluescript- sk,电转化E.coli DH 5α,得到乌苏里蝮蛇毒腺c DNA文库,测定丝氨酸蛋白酶上游氨基酸序列,并推导其基因序列,合成引物。从该c DNA文库克隆丝氨酸蛋白酶基因,并进行序列测定和分析。结果:该文库库容为2 .3×10 6 ,该c DNA文库为筛选新的目的基因和进一步基因操作提供了有效平台。序列测定和分析显示丝氨酸蛋白酶基因开框读码序列全长70 2个核苷酸,编码2 34个氨基酸,活性中心His4 1 、Asp86 、Ser1 80 和6对二硫键进化上高度保守。结论:该文库库容大于通用的10 5标准,符合规定可作为进一步基因操作平台,克隆的丝氨酸蛋白酶基因与Gene Bank中其他蛇毒丝氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性在85 %以上。