辐射诱导细胞周期调控和DNA损伤反应相关基因表达变化的实验研究

采用实时定量PCR技术检测小鼠胸腺和脾脏基因表达对X射线全身照射的反应,为探索可行的辐射生物标志物打下实验基础。研究中选用细胞周期调控和DNA损伤反应相关基因Cdkn1a、Ccnd1、Ccnb1、Gadd45a、Atm和Fdxr,以Gapdh为参考基因,观察0.5、1、2、4、6 Gy X射线全身照射后4和24小时上述基因在胸腺和脾脏的相对表达量的变化。同时计数骨髓细胞涂片嗜多染红细胞(PCE)的微核率进行对比。结果显示,上述6种基因对电离辐射全身作用都出现变化,但以Cdkn1a、Ccnd1和Ccnb1三者对全身照射的剂量效应关系较为明显,其中Cdkn1a和Ccnd1基因的表达随辐射剂量增加而升高,Ccnb1基因的表达随辐射剂量增加而下降。剂量效应曲线可拟合为线性-平方方程,其相关系数r为0.851～0.998,p<0.05～0.01。但与嗜多染红细胞微核率进行对比,Ccnd1和Ccnb1的表达只有部分结果与之具有显著的相关关系。Cdkn1a的表达量则不仅随辐射剂量增加而升高,而且与嗜多染红细胞微核率的剂量-效应曲线明显相关,在两器官和两时间点其相关系数为0.950～0.975,p<0.01。另一方面Cd-kn1a表达量变化的幅度较大,照射后4小时和24小时胸腺的最高表达量分别为11.2和11.3倍,脾脏的最高表达量分别为20.6和9.3倍。鉴于实时定量PCR技术适用于快速、高通量检测,通过进一步在人体观察验证,Cdkn1a基因表达变化有可能成为研制新的辐射生物剂量计的候选者。

低剂量X射线诱导小鼠胸腺细胞蛋白质表达及生物活性

目的 :观察低剂量X射线照射的昆明小鼠胸腺细胞蛋白质表达及生物活性。方法 :采用SephadexG- 10 0凝胶过滤和高效液相分析 75mGy全身照射组和假照射组小鼠胸腺细胞蛋白质的表达 ,通过小鼠脾淋巴细胞转化和人外周血淋巴细胞染色体畸变检测蛋白质表达的生物活性。结果 :高效液相分析发现胸腺细胞 2 4 5kD蛋白质照射组明显低于假照射组 ,这种降低的蛋白质组分在终浓度为 6 2 5mg/L时 ,对ConA刺激正常小鼠脾淋巴细胞转化和X射线损伤人外周血淋巴细胞所致染色体畸变分别具有抑制和保护作用。结论 :低剂量辐射兴奋效应可能与2 4 5kD蛋白质的表达下调有关。

睫状神经营养因子cDNA的克隆、表达、纯化及生物活性测定

目的 :利用基因工程技术获得有较高生物学活性的睫状神经营养因子 (CNTF)蛋白。方法 :应用反转录 PCR技术直接扩增出人 CNTF c DNA,克隆入 p UC19载体中 ,用双脱氧法进行手工序列分析 ,构建表达菌株 p BV2 2 0 - CNTF/ DH5α。表达的蛋白质得到纯化 ,用鸡胚背根节无血清培养法检测表达蛋白生物学活性。结果 :所克隆的 CNTF基因序列与文献报道完全一致 ,p BV2 2 0 - CNTF/ DH5α能特异表达分子量大约为 2 6 0 0 0的蛋白质 ,表达量约为菌体总蛋白量的 35 %。 CNTF蛋白质经纯化后纯度约 95 % ,而且表达蛋白有很高的生物学活性。结论 :该研究结果为

诱导型一氧化氮合酶抑制剂抑制胃癌细胞增殖的实验研究

目的 :研究诱导型一氧化氮合酶(iNOS)选择性抑制剂氨基胍 (aminoguanidine ,AG)胃癌细胞增殖效果。方法 :采用MTT法观察AG在不同时间点对MFC细胞增殖的影响 ,Greiss反应法检测对细胞培养上清液中一氧化氮 (NO)含量的影响。应用HE和免疫组化 (SP法 )染色 ,计数肿瘤组织中微血管密度 (MVD)和iNOS阳性率 ,并分析其与AG抑瘤效应的关系。结果 :1)在 0 1～ 10 0mmol/L浓度下 ,AG对MFC细胞生长抑制率与 0 0 0 1mmol/LAG比较 ,P <0 0 1;AG对MFC细胞合成NO具有明显的抑制作用 (与 0mmol/LAG比较 ,P <0 0 1) ,但其作用并不呈时间依赖性。 2 )大、中、小剂量AG对小鼠胃癌移植瘤的抑瘤率分别为5 2 9%、47 1%和 3 5 3 %。MVD阳性率AG大 、AG中 组同对照组比较差异有统计学意义 ,P <0 0 1。iNOS阳性率AG大 、AG中 组同对照组比较差异有统计学意义 ,P <0 0 1。结论 :AG在体外通过阻断NO途径显著抑制MFC胃癌细胞的生长 ,在体内明显抑制小鼠胃癌移植瘤的生长和肿瘤组织中iNOS表达 ,并且能显著降低MVD。

siRNA与肿瘤放射治疗

近年来,放射肿瘤学研究者致力于采用特异性阻断剂阻断DNA修复过程中关键调控基因,并通过有效抑制DNA损伤修复,促进肿瘤细胞死亡,收到较好的肿瘤放疗效果。但是同时发现,阻断剂技术本身存在诸多缺陷,这极大地限制其尽快应用于临床肿瘤治疗。自小片段干扰核糖核酸(smallinterferenceRNA,siRNA)干涉技术发现以来,其强大的阻断真核细胞中特异表达蛋白的能力为众多研究者所关注。更重要的是,它较好地解决了应用阻断剂带来的上述问题,从而为肿瘤放射基因治疗研究提供了新途径。

人参三醇组甙、VitE及VitC对紫外辐射致皮肤损伤的防护机制初探

目的 :探讨紫外辐射致皮肤损伤的药物防护机制。方法 :以细胞凋亡、细胞周期及细胞内SOD、H2 O2 为观察指标 ,研究人参三醇组甙及 Vit E、Vit C对 UVB致人角质形成细胞 ( Colo1 6)损伤的保护作用。结果 :一定剂量 UVB可诱导明显的皮肤角质形成细胞发生 S期阻滞和细胞凋亡 ,可使细胞内 SOD下降、H2 O2 升高 ,人参三醇组甙及 Vit E、Vit C对其均有不同程度的保护作用 :减少 S期细胞数、抑制细胞凋亡、激活细胞内 SOD活性、降低细胞内 H2 O2 。结论 :紫外线照射后细胞内氧自由基变化可能是紫外线致皮肤损伤的机理之一。

低剂量电离辐射诱导小鼠睾丸细胞内质网应激及PERK-CHOP信号通路的激活

目的:探讨低剂量电离辐射与小鼠睾丸细胞内质网应激的发生以及PERK-CHOP通路激活的相关性。方法:健康雄性昆明小鼠随机分成时程-效应(75 mGy照射后0、3、6、12和24 h)和剂量-效应(0、50、75、100和200 mGy照射后12 h)组,每组动物10只。采用H2O2和MDA试剂盒比色法检测其含量;利用实时定量逆转录PCR(quantitative RT-PCR)检测GRP78、PERK和CHOP mRNA;Western印迹和图像分析技术检测GRP78、PERK、磷酸化PERK(phosphorylated PERK,pho-PERK)和CHOP蛋白表达。结果:小鼠经75 mGy全身照射后,睾丸组织中H2O2含量随时间延长而增加,MDA含量在3和6 h稍有降低,而后随时间延长而增加,二者在12和24 h较0 h时显著增加(P<0.05,P<0.01);除了GRP78 mRNA(3和24 h)和蛋白表达(6 h)分别在照射后有降低趋势外,GRP78(12 h)、PERK(3、6、12和24 h)和CHOP(12和24 h)的mRNA表达较0 h显著增加(P<0.05,P<0.01),GRP78(12和24 h)、pho-PERK(3、12和24 h)和CHOP(3、6、12和24 h)的蛋白表达也都较0 h显著增加(P<0.05,P<0.01),PERK蛋白表达则无明显变化规律。小鼠经50～200 mGy全身照射后12 h,睾丸组织中H2O2含量在50～100 mGy照射后随剂量增加而增加,200 mGy照射后则稍有降低,MDA含量随剂量增加而增加,而且H2O2含量(75和100 mGy)和MDA含量(75、100和200 mGy)显著高于0 mGy组(P<0.05,P<0.01);除了GRP78mRNA表达在50和200 mGy照射后有降低趋势外,GRP78(75和100 mGy)、PERK(75、100和200 mGy)和CHOP(50、75、100和200 mGy)的mRNA表达都显著高于0 mGy组(P<0.05,P<0.01),GRP78(100和200 mGy)、pho-PERK(50、100和200 mGy)和CHOP(50、75、100和200 mGy)的蛋白表达也都显著高于0 mGy组(P<0.05,P<0.01),而PERK蛋白表达则无明显变化规律。结论:低剂量电离辐射能够诱导小鼠睾丸细胞发生内质网应激,并且激活PERK-CHOP信号通路。

pcEgr-IFNγ基因治疗联合放射治疗抗肿瘤作用的实验研究

目的 探讨pcEgr IFNγ基因 放射联合治疗对移植黑色素瘤B16小鼠的抗肿瘤作用及其免疫学机理。方法 肿瘤局部注射脂质体包裹的pcEgr IFNγ重组质粒后 36h ,接受 2 0GyX射线照射 ,观察放疗后不同时间肿瘤大小 ,放疗后 3d瘤内IFNγ转录水平和 15d部分免疫学指标。结果pcEgr IFNγ基因 放射联合治疗后第 3～ 15天 ,肿瘤生长速率明显低于单纯照射组 ,照后第 9～ 15天明显低于单纯基因治疗组和空质粒对照组 ;治疗后第 3天 ,pcEgr IFNγ基因 放射联合治疗组瘤内IFNγ表达水平明显高于单纯基因治疗组 ;脾脏NK细胞毒活性、IL 2和IFNγ分泌活性均明显高于单纯放疗组和单纯基因治疗组。结论 pcEgr IFNγ基因 放射联合治疗抗肿瘤作用明显优于单纯放疗和单纯基因治疗组 ,其机理可能与放疗诱导瘤内IFNγ基因表达增强 ,激活荷瘤机体抗肿瘤免疫功能有关。

肝癌H-22细胞膜抗原肽提取物对小鼠免疫功能的影响及其抑瘤作用

目的 应用小鼠肝癌H 2 2细胞膜相关抗原肽 (TAP)提取物免疫小鼠 ,观察其对小鼠自身移植肿瘤生长及免疫学参数的影响 ,为制备肿瘤疫苗提供实验依据。方法 采用微酸洗脱法制备分子量≤ 30 0 0Da的细胞膜TAP提取物 ,皮下免疫小鼠 ,检测胸腺细胞增殖反应、T细胞亚组百分数的变化 ,脾细胞ConA反应性、IL 2和IFN γ活性、CTL杀伤活性的变化及抑瘤效应。结果 TAP提取物免疫后 ,移植肿瘤的发生率降低 (P <0 .0 1) ,平均出现时间延迟 (P <0 .0 0 1) ,生长速度减慢 ;同时 ,脾细胞ConA反应性 (P <0 .0 1)、IFN γ(P <0 .0 5 )和IL 2分泌活性和CTL杀伤活性 (P <0 .0 5 )不同程度增强 ;胸腺细胞3 H TdR自发掺入率 (P <0 .0 5 )及CD4 + 和CD8+ T细胞百分数 (P <0 .0 5 )也有不同程度增高。结论 小鼠肝癌H 2 2细胞膜TAP提取物具有免疫原性 ,能有效激发免疫系统功能 ,抑制自身移植肿瘤的生长。

pEgr-IL18-B7.1质粒辐射诱导表达特性及其联合辐射抗肿瘤作用

目的:构建pEgr-IL18*B7．1双基因表达质粒,探讨不同剂量电离辐射诱导下的表达特性,研究基 因放射治疗对恶性黑色素瘤的抑瘤作用。方法:利用基因重组技术构建包含小鼠IL-18和B7．1的双基因表达质粒 pEgr-IL18-B7．1,分别利用ELISA和流式细胞仪检测不同剂量电离辐射诱导下IL-18和B7-1在体外的表达特性, 以移植肿瘤的生长为判断指标,探讨基因放射治疗对恶性黑色素瘤的抑瘤作用。结果:体外实验证实,双基因表达 质粒pEgr-IL18-B7．1在不同剂量X射线诱导下可有效表达IL-18和B7-1,与放疗联合应用可有效抑制肿瘤生 长。结论:说明多基因联合辐射治疗是有效的抗肿瘤措施之一。

低剂量电离辐射对小鼠腹腔巨噬细胞CuZnSOD活性的影响

采用MTT法观察了低剂量电离辐射对小鼠腹腔巨噬细胞铜锌超氧化物歧化酶 (CuZnSOD)活性的影响 ,同时用较大剂量作为对照 ,观察两者的不同之处 ,而且还利用印迹杂交方法观察了CuZnSOD的mRNA水平变化。结果表明 ,从转录水平上低剂量电离辐射可导致小鼠腹腔巨噬细胞CuZnSODmRNA水平下降 ,而CuZnSOD活性却无明显改变 ;较高剂量电离辐射使小鼠腹腔巨噬细胞CuZnSOD活性在照射后 8—

pNEgr-mIL-12真核表达重组质粒的构建及在COS-7细胞和黑色素瘤B16细胞中的表达

目的 :构建含辐射敏感启动子的 p NEgr- m IL- 1 2真核表达载体 ,转染哺乳动物细胞后经不同剂量 X射线照射 ,检测 m IL- 1 2的表达。方法 :限制性内切酶酶切构建 p NEgr- m IL- 1 2表达载体 ;脂质体转染法转染 COS- 7细胞和 B1 6细胞 ;ELISA法检测 m IL- 1 2 p70表达。结果 :1 p NEgr-m IL- 1 2重组质粒转染瞬时表达细胞 COS- 7细胞 ,经不同剂量 X射线照射后 ,照射组 m IL- 1 2表达量比未照射组明显增高 ( P<0 .0 5 ,P<0 .0 0 1 ) ,约为未照组的 1 .5～ 2 .5倍 ;在 2 .0 Gy照后表达增高最为明显 ,表达于照后 4h达峰值 ,在观察的 72 h内保持于较高水平 ;2转染 p NEgr- m IL- 1 2的B1 6细胞于 2 .0 Gy照后增高明显 ,为未照射组的 1 .5倍 ;并且经 2 .0 Gy X射线照射后随时间延长表达水平逐渐增高 ;低至 0 .0 5 Gy的剂量对两种细胞亦均有激活作用。结论 :p NEgr- m IL- 1 2重组质粒具有辐射激活下游基因表达的功能 ,且经不同剂量 X射线照射后表达均有增强 ,尤以 2 .0 Gy照射组作用明显 ,但在低剂量 5 0、75、1 0 0 m

不同剂量电离辐射对小鼠树突状细胞(DC)表型及功能的影响

采用流式细胞术和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测0.075 Gy及2.0 Gy X射线照射6、12、24、48、72 h后DC/TLC共培养体系中小鼠树突状细胞(DC)表面CD80、CD40分子表达及其分泌细胞因子IL-12、IL-27的变化,探讨电离辐射对DC在免疫反应中的作用。结果显示共刺激分子CD80和CD40及细胞因子IL-12在0.075 Gy照射后与对照组相比表达量均升高,而2.0 Gy照射后其表达量则降低;但IL-27在高、低剂量照射后其表达量均增加。上述结果表明,电离辐射在体外可以诱导DC表型变化及细胞因子分泌的变化,该结果将为辐射免疫效应提供新的实验依据。

血管内皮生长因子重组DNA的构建及体外表达

目的 :以质粒 PCNDA3.0为载体 ,研究血管内皮生长因子 ( VEGF)目的基因在体外真核细胞中的表达。方法 :将编码人可溶性 VEGF165的目的基因克隆于带有 CMV启动子 /增强子的PCNDA3.0载体上 ,重组为 PCNDA3.0 - VEGF165质粒载体。直接以质粒 DNA形式应用脂质体介导的方法转染人脐静脉内皮细胞 ECV30 4 ,收取细胞上清 ,用 ELISA和 Western blot方法检测上清中 VEGF165可溶性表达产物。结果 :VEGF165基因在 CMV启动子 /增强子的调控下 ,可在ECV30 4细胞高效表达 ,且在转染后 72 h表达量明显高于转染后 48h的表达。结论 :以质粒PCNDA3.0为载体 ,VEGF165基因可以在体外真核细胞中表达 。

^(125)I-脱氧尿嘧啶核苷对重组质粒pcDNAEgr-IFNγ体外辐射诱导表达的作用

目的研究125I-脱氧尿嘧啶核苷对重组质粒pcDNAEgr-IFNγ在体外培养B16细胞中的辐射诱导表达作用。方法以脂质体介导法将pcDNAEgr-IFNγ重组质粒转染B16细胞,48h后,于培养液中加入125I-UdR,使其终放射性浓度分别为0(空白对照)、1、5、10、20、50kBq/ml,24h后,采用ELISA法定量检测细胞上清中IFNγ。结果转染组细胞IFNγ蛋白表达随着细胞培养液中125I-UdR浓度的增高而增高,放射性浓度为5、10、20、50kBq/ml组IFNγ的蛋白表达明显高于0kBq/ml组(P<0.05~0.001),其中50kBq/ml组表达量最高,为0kBq/ml组的3.66倍;加入50kBq/ml125I-UdR后6h上清中IFNγ表达量即明显升高(P<0.05~0.001),并随时间延长逐渐增加,照后48h达峰值,表达量为未加入125I-UdR时的6.51倍。结论pcDNAEgr-IFNγ重组质粒在125I-UdR诱导下可有效表达IFNγ,并且其辐射诱导IFNγ基因表达增强特性具有一定的量效和时程规律。

早期流产的血清、绒毛及蜕膜中微量元素检测及其临床意义

采用原子吸收分光光度计和荧光分光光度计检测吉林大学一院门诊早期人工流产 (人流组 ) 30例和自然流产 (自流组 ) 30例的血清、绒毛、蜕膜中 5种必需微量元素 (锌、铜、铁、硒、铷 )的含量 ,探讨其正常值范围及其失调与自然流产的关系。结果表明 ,在绒毛中自流组锌、铜、铁和硒含量均明显低于人流组 (P <0 . 0 5、 P <0 . 0 1或 P <0 . 0 0 0 5 ) ,铷的含量却高于人流组 (P <0 . 0 0 1) ;在蜕膜中锌、铜、铁和硒的含量自流组均明显低于人流组(P <0 . 0 0 1或 P <0 . 0 0 0 5 ) ,但锌含量在两组比较中无统计学意义 (P <0 . 2 5 ) ,铷的含量也明显高于人流组 (P<0 . 0 0 1)。在血清中锌、铜、铁和硒的含量人流组明显高于自流组 (P <0 . 0 5 ) ,铷的含量却明显低于自流组 (P <0 . 0 0 1)。提示 ,血清、绒毛和蜕膜中低锌、铜。

小鼠白细胞介素12基因的钓取及其在COS-7细胞中的表达

目的 :钓取小鼠白细胞介素 12 (m IL- 12 ) p4 0和 p35c DNA并检测其在哺乳动物细胞 (COS- 7)中的表达。方法 :RT- PCR法从小鼠腹腔巨噬细胞 m RNA中扩增 p4 0和 p35亚基 ;脂质体Lipofect AMINE将质粒 p NG- m IL- 12转染至 COS- 7细胞 ,ELISA法检测不同时间 m IL- 12表达水平。结果 :1RT- PCR法扩增出特异的 p4 0和 p35亚基 ,p35亚基克隆至 p KS载体测序 ;2 EL ISA法检测转染 p NG- m IL- 12的 COS- 7细胞上清有 m IL- 12分泌。结论 :为进一步研究 m IL- 12的免疫调节机制及其抑瘤作用奠定了基础。

小鼠胎儿胸腺T细胞体外培养的分化和成熟

目的 :观察 BALB/ c小鼠胎儿胸腺 T细胞体外培养的分化和成熟。方法 :采用小鼠胎儿胸腺器官体外培养体系及流式细胞术测其 T细胞 CD4、CD8和 TCR的表达。结果 :受孕 15 d胎鼠胸腺 T细胞主要为 CD4 -CD8-细胞 (96 .0 % ) ;体外培养 3d后 ,大部分分化为 CD4 + CD8+ 细胞 (6 5 .4 % ) ,小部分成熟为 CD4 + CD8-(14.3% )和 CD4 -CD8+ (11.2 % )细胞 ;培养 5 d后 ,CD4 + CD8+ 细胞 (5 9.7% )减少 ,而CD4 + CD8-(14.3% )和 CD4 -CD8+ (15 .8% )增多 ;培养后 10 d,CD4 + CD8+细胞降低到 4 7.2 % ,CD4 + CD8-和 CD4 -CD8+ 细胞分别增加到 2 0 .0 %和 2 4 .9% ,同时 TCR明显表达。结论 :应用小鼠胎儿胸腺器官培养体系进一步通过胸腺细胞的阳性和阴性选择证实其 T细胞的分化和成熟过程。

X射线对小鼠脾细胞内P16、cyclinD1和CDK4表达的影响

目的 :探讨 X射线对小鼠脾细胞内 P1 6、cyclin D1和 CDK4表达的影响。方法 :采用细胞间接荧光标记法、FACScan流式细胞仪检测不同剂量 X射线全身照射后小鼠脾细胞内 P1 6、cyclinD1和 CDK4三种蛋白表达的时程变化和量效关系。结果 :2 .0 Gy X射线照后 2 4 h小鼠脾细胞 P1 6表达明显高于假照组 ;CDK4表达水平在照后 8h明显降低 ,持续至照后 72 h仍低于正常水平。周期蛋白 cyclin D1表达轻度下调。不同剂量照射后 P1 6蛋白表达呈剂量依赖性增加 ,1 .0～ 4.0 Gy组与假照射组相比显著增多 ( P<0 .0 5 ,P<0 .0 1 ) ;cyclin D1蛋白表达随剂量升高有降低趋势 ;CDK4亦呈剂量依赖性降低 ,0 .5～ 6.0 Gy组与假照组比较差异具有显著性 ( P<0 .0 5 ,P<0 .0 1 )。结论 :P1 6/cyclin D1 /CDK4/p Rb通路在电离辐射诱导脾细胞