硒、维生素E和多不饱和脂肪酸复合作用与克山病发病关系的研究

目的 :研究硒 (Se)、维生素 E(VE)及多不饱和脂肪酸 (PUFAs)三因素复合作用与克山病发病的关系。方法 :测定南北方典型克山病病区主食粮中 VE及 Se含量 ,并用克山病病区粮 (及其添加豆油 )饲料喂养大鼠 70 d,测定各组织中 α-、γ-生育酚 (α- ,γ- Toco)等含量。结果 :病区玉米和大米在 Se低的同时 ,α- Toco含量亦显著低于非病区对照。饲克山病病区粮饲料大鼠血浆、红细胞膜、心肌线粒体、肝线粒体均处于低 α- Toco状态。饲料中添加富含 PUFAs的豆油时 ,细胞膜中 α- Toco含量进一步下降 ,血浆LPO、CK、α-羟丁酸脱氢酶 (α- HBDH)显著增加。结论 :PUFAs长期负荷 ,可使实验动物体内抗氧化能力下降 ,细胞膜严重受损 ;Se、VE及

硒和维生素E缺乏诱导大鼠心脑组织转化生长因子-β1表达增强的研究

目的 从 TGF- β1 m RNA基因调控变化的角度阐明硒 (Se)和维生素 E(VE)缺乏对大鼠心脑组织损伤的作用机制。方法 通过 Se和VE缺乏的半合成人工饲料喂养大鼠 ,建立 Se和 VE缺乏疾病大鼠动物模型。并采用 RT- PCR检测 TGF-β1 在心脑组织中 m RNA表达变化特点。结果 低 Se低 VE组大鼠心肌可见散在微小灶状心肌坏死 ,脑组织海马、皮层可见神经细胞数量相对减少 ,部分神经细胞周围间隙增宽。 Se和 VE单项缺乏及联合缺乏 TGF-β1 m RNA表达均增高。以 Se和 VE联合缺乏变化最显著。结论 Se和 VE缺乏可诱导大鼠心脑组织 TGF-β1 m RNA表达上调 ,是缺血缺氧性心肌坏死和脑组织损伤的原因之一。 Se和 VE作为抗氧化微量营养素具有细胞保护作用 ,有实际应用价值。

营养性低钙与慢性氟中毒大鼠细胞内钙超载相关性研究

目的探讨营养性低钙与慢性氟中毒细胞内钙超载的相关性。方法采用饮水加入氟化钠进行大鼠染毒实验,配以低钙饮食,应用Fura-2／AM荧光指示剂标记单细胞,显微荧光标记测定慢性氟中毒大鼠肝、肾、脑细胞内游离钙([Ca2+]i)的变化。结果氟可刺激细胞内[Ca2+]i水平增高,正常饮食投氟组肝、肾、脑细胞内[Ca2+]i水平分别为(124．11±11.35)、(127．20±14．40)、(136．75±15．91)nmol／L,与正常饮食对照组(86．37±27．55)、(95．65±8．75)、(99．20±12．89)nmol／L比较,差异有统计学意义(t=4．001、4．706、4．953,P< 0．05);低钙饮食+氟组肝、肾、脑细胞内[Ca2+]i水平[(151．57±19．61)、(162．62±31．41)、(158．79±27．65) nmol／L]与低钙饮食对照组[(103．17±14．29)、(103．59±11．40)、(115．26±30．91)nmol／L]比较,差异有统计学意义(t=4．789,P<0．05;t=8．581、6．003,P<0．01);低钙饮食+氟组骨病变明显:细胞内[Ca2+]i水平与血清离子钙(i[Ca])、总钙(t[Ca])呈负相关(r=-0．59)。结论慢性氟中毒可致机体组织细胞钙超载,低钙可加重氟中毒时的细胞内钙超载,提示细胞内钙超载可能参与氟骨症发病机制并起着重要作用。

慢性氟中毒鼠神经元与细胞凋亡相关基因的研究

目的 研究慢性氟中毒对神经细胞损伤的作用机理及与细胞凋亡的关系。方法 利用RT PCR方法观察细胞凋亡相关基因B细胞淋巴瘤 /白血病 x(Bcl x)和白细胞介素 1β转换酶 (ICE)在慢性氟中毒鼠脑组织中的表达水平。结果 慢性氟中毒时脑组织中的Bcl x表达未受明显影响 ;ICE则明显高于正常对照组。结论 慢性氟中毒所致的神经细胞凋亡可能与激活G蛋白或氧化应激有关。当发生慢性氟中毒时 ,无明显证据表明Bcl x参与了此过程 ,但也不除外Bcl x在参与慢性氟中毒对神经细胞的损害过程中发挥作用并调节其表达水平达到平衡的可能性 ;ICE则可能参与了神经细胞发生凋亡的过程 。

家兔慢性氟中毒骨骼病理与形态计量学研究

目的 着重观察过量氟对骨转换中成骨细胞的作用。方法 常规兔饲料饲养家兔 ,经饮水投氟 (2 0 0mg/ L 或 40 0 mg/ L,3个月 )复制家兔氟中毒模型。结果 加氟组家兔可见骨外膜下骨赘生成、松质骨骨小梁增粗、骨样组织增多、皮质骨松化、骨髓纤维化等改变。结论 成骨细胞功能活跃在氟骨症病变中是一个发生较早、并且起主导作用的环节 ;

大鼠慢性氟中毒神经细胞病理改变的研究

目的 研究慢性氟中毒对神经细胞的作用机制及病理改变。方法 利用光电镜观察了慢性氟中毒大鼠脑组织的病理学改变。结果 慢性氟中毒大鼠脑组织光镜下的病理改变主要表现在海马 CA4区 ,以神经细胞核浓度、固缩、顶树突明显拉长为特点 ;电镜下的病理改变与光镜的改变一致。结论 慢性氟中毒鼠脑组织的病理改变具有选择性易损的特点 :最易受损的部位是海马 CA4区 。

组织工程软骨修复全层大面积关节软骨损伤的实验研究

目的 观察由软骨细胞体外培养的人工软骨组织对家兔膝关节软骨全层缺损修复的可行性。方法 分离收集兔软骨细胞 (4周龄 ) ,用培养液悬浮 ,经离心管体外培养成组织工程软骨 ,然后植入兔膝关节股骨负重面的缺损 (5mm× 4mm)部位 ,观察 2 ,4,8,12周软骨缺损的修复情况 ,并进行大体和组织学观察。结果 移植后第 8周 ,移植部位填充物与宿主已完全整合 ,缺损处表面光滑 ;组织学显示 ,缺损部位新生软骨与所移植软骨有较好的连续性 ,并且缺损底部有软骨下骨及海绵状骨生成 ;对照组 (未移植组 ) ,从组织学观察到缺损部位呈纤维样修复 ,未见有由新生软骨细胞形成软骨组织。

小剂量NOS抑制剂对局灶性脑缺血病理改变影响的研究

目的 研究NO在局灶性脑缺血再灌流过程中对病理改变的影响 ,并探讨其机制。方法 利用光、电镜及TUNEL法观察了NNLA干预后局灶脑缺血大鼠脑组织的病理学改变。结果 缺血、再灌流 1d时光镜下皮质、海马区均可见神经细胞呈坏死样改变 ;电镜下半影区神经细胞的改变仅见于核染色质凝集 (类似凋亡小体 )和小胶质细胞核变形 ,以细胞凋亡为主 ;小剂量给予NNLA干预后坏死和凋亡的病理改变均较手术对照组轻。TUNEL显示与病理改变结果一致。结论 局灶性脑缺血后 ,调节NO生成量在适当范围 ,可以达到保护。

维生素E对柯萨奇B_3病毒感染的心肌细胞保护作用的研究

目的 探讨维生素E抗柯萨奇病毒及对感染病毒的心肌细胞的保护作用。方法 应用一定浓度的维生素E作用于柯萨奇病毒B3 感染的心肌细胞 ,待病毒对照组细胞病变达 ++++时 ,以MTT法测定细胞存活率 ,应用全自动生化分析仪测定细胞上清液中的心肌酶活性。结果 实验组的细胞存活率明显高于病毒对照组 ,心肌酶活性明显低于病毒对照组。结论 维生素E有一定的抗病毒作用 。

地氟病属于“钙矛盾疾病”

膳食低钙是地氟病病区居民中的普遍现象 ,是地氟病 (氟骨症 )的主要促发和加重因素。低钙的作用不仅在于增加肠道氟的吸收 ,更在于它和过量氟同样都可引起甲状旁腺激素分泌增多 ,都可促进成骨、破骨功能活跃。过量氟可进一步加重机体缺钙。我们最近的研究证明 ,氟中毒大鼠肝、肾、脑组织 [Ca2 + ]i 升高 ,培养的成骨细胞样细胞染氟后细胞内钙亦增加 ;即氟中毒存在着全身缺钙继而细胞内钙增多的钙矛盾现象 ,属于钙矛盾疾病。为控制和消除地氟病危害 。

Se和VE对大鼠心肌组织TGF-β_1mRNA表达的影响

目的探讨Se和VE对大鼠心肌组织TGF鄄β1mRNA表达的影响。方法通过Se和VE缺乏的半合成人工饲料喂养大鼠,采用RT鄄PCR检测TGF鄄β1mRNA在心肌组织的表达特点。结果Se和VE联合缺乏组大鼠心肌可见散在微小灶状心肌坏死。与补Se补VE组比较,Se或VE单项缺乏组TGF鄄β1mRNA表达已有所增高(P<0.01),Se和VE联合缺乏组TGF鄄β1mRNA表达增高最显著(P<0.001)。结论Se和VE缺乏可诱导大鼠心肌组织TGF鄄β1mRNA表达上调,TGF鄄β1可能亦参与了Se和VE联合缺乏所致心肌损伤的病理过程。

氟化物对成纤维细胞和成骨细胞骨形态发生蛋白-2表达的影响

目的观察氟化物对成纤维细胞和成骨细胞骨形态发生蛋白-2（BMP-2）表达的影响。方法采用体外细胞培养的方法，将细胞分为对照组和6个染氟（F^-，0．1、1．0、100．0、1000．0、10000．0、20000．0μg／L）组，分别在5个染氟时间段（2、4、24、48、72h）收集培养上清液和细胞，应用酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫组化方法检测BMP-2蛋白，RT-PCR方法检测染氟48hBMP-2mRNA的表达。结果与对照组比较．成纤维细胞染氟48hBMP-2mRNA表达呈普遍增强趋势，但差异无统计学意义（P〉0．05）；免疫组化检查，可见染氟0．1、1．0、1000．0μg／L组成纤维细胞BMP-2阳性着色较对照组增强；染氟72h，培养上清中BMP-2蛋白在1．0、100．0、20000．0μg／L组分别为（0．11±0．01）、（0．11±0．01）、（0．11±0．01），与对照组（0．07±0．01）比较有明显增高（P〈0．05）。与染氟成纤维细胞比较，染氟成骨细胞BMP-2mRNA和蛋白表达升高出现早．持续时间较长．增强程度更为明显。结论成纤维细胞和成骨细胞在氟化物的刺激下，BMP-2mRNA和蛋白表达有所升高，推测BMP-2可能是氟化物诱导成纤维细胞中成骨细胞核心结合因子α1（cbfa1）和骨钙素（OCN）表达的重要中介环节。

氟化物对成骨细胞OPGL mRNA和M-CSF mRNA表达的影响

目的 探讨氟对成骨细胞的骨保护蛋白配体 (OPGL)mRNA和巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF)mR NA表达的影响。方法 应用酶消化法分离小鼠乳鼠成骨细胞 ,取第 3代成骨细胞 ,加入不同浓度的氟 6h ,提取细胞总RNA ,通过逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,观察成骨细胞分泌的OPGL和M CSF表达的变化。结果 在氟的作用下 ,成骨细胞的OPGLmRNA和M CSFmRNA的表达呈上升趋势 ,但未达到统计学差异水平。结论 氟有可能通过上调OPGL和M CSF的表达 。

不同剂量氟对大鼠成骨细胞激活与BMP-4、BMP-2和Smad-4表达的影响

目的探讨过量氟对大鼠成骨细胞系BMP-2、BMP-4及其信号转导物Smad-4表达水平的影响及其与氟骨症发病机制的关系。方法利用饮水加入氟化钠(NaF)进行大鼠染氟实验,采用原位杂交技术、 Western blot技术、免疫组织化学方法,对氟中毒大鼠骨组织成骨细胞系进行BMP-4、Smad-4的mRNA水平和 BMP-2、BMP-4蛋白质水平的定量分析。结果 NaF可刺激慢性氟中毒大鼠椎骨各包被成骨细胞增殖,并诱导 BMP-2、BMP-4和Smad-4的表达。在低钙偏食组慢性氟中毒大鼠BMP-4、Smad-4 mRNA和BMP-2、BMP-4 蛋白质水平稍增高但与对照组相比差异无统计学意义(P>0．05);在高钙和低钙加氟组Smad-4 mRNA的表达均增高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0．001);在低钙加氟组Smad-4 mRNA水平与BMP-4 mRNA水平和BMP-2、BMP-4蛋白质表达水平具有一定相关性(r=0．53)。结论过量氟可刺激大鼠成骨细胞系激活、增殖能力增强,但在增殖能力增强的成骨细胞中BMP-4 mRNA和BMP-2、BMP-4蛋白质水平表达无明显增高,可能与氟骨症的骨化不良有关;NaF刺激Smad-4 mRNA过表达可能与氟骨症骨相损害的信号转导途径激活有关。

氟对成纤维细胞Ⅰ型胶原表达和成骨结节形成的影响

目的 研究氟化物对成纤维细胞Ⅰ型胶原表达和成骨结节形成的影响。方法 将成纤维细胞分为对照组和6个加氟组，氟质量浓度分别为0．0001、0．0010、0．1000、1．0000、10．0000、20．0000mg／L。应用RT—PCR法和ELISA法检测各组成纤维细胞Ⅰ型胶原tuRNA和蛋白的表达。同时应用茜素红染色法观察矿化诱导液对成纤维细胞成骨结节形成的作用。结果 染氟2h的0．0001、0．0010、0．1000mg／L组，染氟4h的0．1000mg／L组．染氟24h的1．0000、10．0000、20．0000mg／L组及染氟72h的10．0000、20．0000mg／L组成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白水平明显升高：染氟48h成纤维细胞Ⅰ型胶原tuRNA的表达增强趋势明显。染氟10d，受矿化诱导液诱导的成纤维细胞出现集中现象。并形成较多数量、大小不等的成骨结节，有明显的钙盐沉积。结论 氟化物可明显促进成纤维细胞成骨表型表达和成骨活动增强。

氟对成纤维细胞和成骨细胞核心结合因子α1表达的影响

目的观察不同剂量氟化物在不同时间段对成纤维细胞和成骨细胞核心结合因子α1(cbfa1)表达的影响。方法采用细胞培养的方法,将细胞分为对照组和6个染氟组(0．1、1．0、100．0、1000．0、10 000．0、20 000．0μg／L),分别在5个染氟时间段(2、4、24、48、72 h)收集培养细胞培养上清液和细胞,应用酶联免疫吸附(ELISA)法和免疫组化方法检测cbfa1蛋白含量和表达,应用RT-PCR方法检测染氟48 h cbfa1 mRNA的表达。结果①与对照组比较(2．13±0．07),成纤维细胞染氟48 h时,cbfa1蛋白含量在0．1、1．0、100．0、1 000．0、20 000．0μg／L组[(2.35±0．08)、(2．28±0．09)、(2．32±0．09)、(2．25±0．08)、(2．28±0．09)]及染氟72 h的10 000．0μg／L组(2．48±0．22)明显升高;染氟48 h,cbfa1 mRNA表达呈升高趋势,其中10 000．0μg／L组(1．29±0．30)与对照组(1．02±0．12)比较,明显增强;免疫组化结果显示,染氟48 h的0．1μg／L组成纤维细胞内可见明显cbfa1阳性表达。②在成骨细胞,染氟组cbfa1蛋白含量较对照组有不同程度增加;染氟48 h时,0．1、1．0、100．0、1 000．0μg／L组cbfa1 mRNA表达较对照组(1．27±0．20)升高,其中0．1μgL组(1．34±0．19)明显升高。结论氟能提高成纤维细胞和成骨细胞cbfa1蛋白含量,促进cbfa1和cbfa1 mRNA表达,成纤维细胞可能在氟骨症骨周化骨的发生中起重要作用。

氟对大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的研究不同剂量的氟对体外培养大鼠乳鼠成骨细胞中Ⅰ型胶原表达的影响。方法体外培养Wistar大鼠乳鼠成骨细胞,给予不同剂量的氟,提取RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ⅰ型胶原mRNA:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测培养液上清中的Ⅰ型胶原蛋白质。结果与对照组相比,1、2及4 mg／L F-均能促进Ⅰ型胶原表达,但在蛋白质表达方面培养48 h后只有2、4 mg／L F-组与正常对照组差异有统计学意义(P<0．05),而在培养72 h后各加氟组与正常对照组相比差异均有统计学意义(P< 0．01);在mRNA表达方面培养48 h后只有2 mg／L F-组与正常对照组差异有统计学意义(P<0．01),而在培养 72 h后2 mg／L F-和4 mg／L F-组与正常对照组相比差异均有统计学意义(P<0．01)。结论氟可促进成骨细胞Ⅰ型胶原的表达,且与氟化物水平以及作用时间有关。

氟对体外培养的小鼠成骨细胞增殖活力的影响

目的 观察不同浓度氟对体外培养的小鼠成骨细胞增殖活力的影响。方法 采用胶原酶消化分离培养小鼠乳鼠颅盖骨成骨细胞 ,应用四唑盐 (MTT)比色法 ,观察氟对培养的成骨细胞增殖活力的影响。结果 染氟 0 .5mg/L以下 ,细胞增殖活力变化不明显 ,染氟 1.0～ 4.0mg/L时成骨细胞增殖活力明显增强 ,与对照组比较差异有显著意义 ,且此作用呈剂量和时间依赖性。结论 氟在一定剂量范围对体外培养的小鼠成骨细胞的增殖有促进作用。

过量氟对肾细胞内游离钙及钙泵的影响

目的探讨过量氟对肾细胞内游离钙([Ca2+]i)及钙泵(Ca2+-ATPase)的影响及[Ca2+]i在肾损害发生机制中的作用。方法应用饮水投氟方式喂养Wistar大鼠20周和原代培养肾小管上皮细胞染氟,采用生物化学方法检测血清内离子钙和总钙水平及肾细胞Ca2+-ATPase活性变化;使用Ca2+指示剂Fura-2测定肾细胞[Ca2+]i。结果肾细胞[Ca2+]i水平在常食投氟组和偏食投氟组较相应对照组明显增多;暴露于低钙高氟环境中的大鼠血清总钙降低,离子钙降低达到显著程度,该组肾细胞的钙泵(Ca2+-ATPase)活性比富钙投氟组明显低;低氟(1.0-5.0mg/L)处理肾小管上皮细胞钙泵活力明显增高,但随着氟水平的提高(>7．5mg／L),Ca2+-ATPase活力明显下降。结论高氟直接抑制钙泵活性很可能造成肾细胞内[Ca2+]i潴留,而[Ca2+]i升高很可能是过量氟导致肾损害的一种重要机制。