基于超星学习通的医学分子生物学进阶式混合教学模式的构建

医学分子生物学是临床医学本科教育开设的必修课程,但传统的课堂教学方式已经不能满足学生全面发展的需要。以学习进阶为基础构建分子生物学的线上线下混合式教学模式,包括以“超星学习通”线上平台为依托,融合多种教学方法对课前、课中及课后内容的整合,促进认知进阶的教学过程设计和效果导向的课程评价设计,并形成过程性与终结性评价相结合的多元化教学评价体系,以此来提高教学效果及学生的认知水平,培养医学生的创新思维,为日后混合式教学模式的进一步改革提供参考。

临床医学专业硕士研究生分子生物学教学改革研究

分子生物学理论和技术推动着整个生命科学领域的发展。为了提高硕士研究生分子生物学的教学效果,为分子生物学培养素质型人才提供有益的参考,文章通过研究新入学硕士研究生对分子生物学理论知识掌握程度,从教学内容的改革,理论知识与临床应用相结合的教学模式,理论与科研实例相结合的教学模式,教师引导下自主学习的教学方法,实验课考核方式的改革五个方面探讨了分子生物学教学改革。

关于分子生物学教学改革的思考

为了培养学生的动手能力和创新精神,文章对分子生物学教学改革进行了探究,从学生的重视度不足、知识掌握难度大,以及改善分子生物学理论课程教学,加强分子生物学实验室基本技能训练课程,加强课间科研训练课程教学,建设教师队伍,改进实践教学方法,改革考试方法,注重实践教学平台建设,评估教师综合能力几个方面分析了分子生物学教学改革。

瞬时转染后WAF1基因对肠癌细胞株Hct/8的生物学效应

目的 :探讨外源基因 WAF1的转染、表达活性和生物调控作用。方法 :采用脂质体转染技术将外源基因 WAF1转入 Hct/ 8细胞 ;经免疫荧光染色和流式细胞仪分别监测外源基因的表达和对细胞分化增殖、细胞凋亡的调控作用。结果 :外源基因 p2 1 WAF1/CIP1- pc DNA3在 Hct/ 8细胞阳性表达为 89.6% ,显著高于空质粒对照和空白对照组 ( P<0 .0 1 ) ;转染 48h后细胞分裂减慢 ,2 4～48h凋亡指数开始增高 ,72 h达到高峰 ,以后逐渐下降。结论 :克隆的外源基因 WAF1具有表达活性及诱导 Hct/ 8细胞凋亡的作用 ,揭示

吉林双阳梅花鹿成纤维细胞生长因子10的克隆和基因分析

根据多个物种的成纤维细胞生长因子10的序列,设计了特异的引物,从吉林双阳梅花鹿子宫cDNA文库中得到了梅花鹿成纤维细胞生长因子10,并应用多种数据库和软件对其进行了分析.

Prohibitin 2调节肌细胞增强因子2转录因子活性的分子机制

目的:探讨Prohibitin 2(PHB2)抑制肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor,MEF2)转录因子活性的分子机制,为进一步研究PHB2在其他MEF2阳性表达细胞中的调控作用提供依据。方法:利用脂质体转染方法将表达PHB2和MEF2的真核表达载体与荧光素酶报告基因载体共转染入体外培养的Hela细胞中,转染36 h后,裂解细胞获取细胞裂解上清,Western blotting检测上清中重组蛋白的表达及利用发光检测仪检测上清中荧光素酶的生物发光活性。结果:转染PHB2细胞组与未转染PHB2细胞组中,MEF2调控的荧光素酶生物发光活性比分别为0.28±0.02和1.00±0.02,两组比较差异具有显著性(P<0.01),且降低程度与PHB2的表达量呈正比;在未转染PHB2细胞组,MEF2转录激活区调控的荧光素酶生物发光活性比为9.53±1.06,而在转染PHB2细胞组其为2.24±0.21,两组比较差异具有显著性(P<0.01);组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂TSA处理组与未处理组,共转染PHB2细胞中MEF2调控的荧光素酶生物发光活性比分别为0.98±0.12和0.38±0.04,两组比较差异具有显著性(P<0.01),提示TSA解除了PHB2对MEF2的抑制作用。结论:PHB2抑制MEF2转录活性的分子机制是通过作用于MEF2的转录激活区由HDAC介导完成的,该抑制作用非依赖于成肌调节因子MyoD,且与MEF2的DNA结合功能无关。

ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达

[目的 ]研究ULBP3基因的功能 ,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣 10重组融合蛋白。 [方法 ]将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒 pET2 8a -chaperonin10中chaperonin10基因的下游 ,构建chaperonin10 -ULBP3融合基因的 pET2 8a原核表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,以IPTG诱导表达 ,Westernblot鉴定。 [结果 ]酶切鉴定证实 ,chaperonin10 -ULBP3融合基因的 pET2 8a原核表达载体构建正确 ,该原核表达载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后 ,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10 -ULBP3重组融合蛋白。 [结论 ]成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白 ,可进一步用于ULBP3功能实验研究。

T-2毒素免疫毒性分子机制的研究进展

T-2毒素是由镰刀菌代谢产生的一种毒性很强的霉菌毒素,是单端孢霉稀族类毒素的一种。T-2毒素具有典型的免疫毒性特征,目前已证实了T-2毒素诱导的免疫毒性与氧化应激、炎症反应、凋亡及自噬等分子机制有关,涉及多条信号通路,调节与免疫应答和细胞凋亡/存活相关的信号分子表达。氧化应激是T-2毒素诱导DNA断裂和凋亡的关键毒性机制,细胞凋亡通路维持毒素免疫调控的动态平衡,而自噬可促进T-2毒素诱导的免疫抑制,在免疫调控中发挥着关键而复杂的作用。此外,T-2毒素免疫调控中也存在类似“免疫逃逸”的机制。本综述对T-2毒素的免疫毒性及其毒性作用的分子机制进行了详细阐述,为T-2毒素的毒性机制及防控研究提供参考。

重组人白细胞介素-4融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达的影响因素

目的 提高人重组白细胞介素 4 (rhIL 4 )在大肠杆菌中的表达量。方法 研究rhIL 4的体外诱导条件 ,包括诱导时间、IPTG浓度、诱导温度、菌体密度对表达量的影响。结果 最佳表达条件是诱导时间为 4h ,诱导温度为 4 2℃ ,A6 0 0 为 0 7～ 1 0 ,而IPTG的浓度对表达量无显著影响。结论 诱导时间、诱导温度和菌体密度的优化能提高外源基因在大肠杆菌中的表达产量。

O型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白疫苗的构建、表达和纯化

目的为了克服灭活口蹄疫病毒疫苗可能存在的传播病毒的潜在危险,构建一种能预防O型口蹄疫病毒感染的VP1表位重组蛋白疫苗。方法采用O型口蹄疫病毒(FMDV)表面VP1蛋白上的B细胞表位肽和T细胞表位肽,以PCR扩增和克隆连接等方法构建VP1表位六聚体重组蛋白(VP1epi)基因,并在大肠杆菌中进行诱导表达,镍亲和层析纯化。用ELISA法检测VP1epi免疫豚鼠血清中抗FMDV抗体的水平。结果构建了一种由FMDV表面VP1中B细胞表位肽重复六次的蛋白质多肽,采用pET28原核表达系统,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达产量约占菌体蛋白的30%左右,经镍亲和层析后获得纯度高于90%的VP1表位重组蛋白。VP1epi免疫的豚鼠血清中含有一定量的抗FMDV抗体。结论VP1epi重组蛋白能诱导机体产生抗O型FMDV的抗体,说明这种重组蛋白可能成为预防O型FMDV感染的基因工程蛋白质疫苗。

HSP65-MUC1/HSP65抗体免疫复合物对人树突状细胞的活化作用

目的 :探讨免疫复合物能否诱导树突状细胞的活化与成熟。方法 :用免疫复合物刺激来自人外周血经细胞因子 IL - 4和 GM- CSF诱导的未成熟的树突状细胞 ,观察免疫复合物对未成熟树突状细胞的活化与成熟的影响。结果 :HSP6 5 - MUC1/ HSP6 5免疫复合物与 HSP6 5 - MU C1抗原或 HSP6 5抗体相比较 ,能够显著地活化树突状细胞 ,使其表面的协同刺激分子 CD86的表达显著上调 ,为激活细胞毒性 T淋巴细胞提供第二信号 ,这一结果说明免疫复合物具有交叉递呈的作用 ;同时 ,加入免疫复合物的树突状细胞培养上清中 IL - 6和 TNFα分泌量明显增加。结论 :免疫复合物能够诱导树突状细胞的活化与成熟 ,免疫复合物具有交叉递呈的作用。

重组卡介苗热休克蛋白70的纯化及内毒素去除的效果评价

目的:表达、纯化重组卡介苗热休克蛋白70(BCGHSP70)并去除其中的内毒素。方法:采用10L发酵罐经IPTG诱导表达含有重组表达质粒pET28a/HSP70的BL21(DE3)工程菌(pET28a/HSP70/BL21),SDS-PAGE检测BCGHSP70的表达。超声破碎菌体,裂菌后上清依次经过NiSepharose4B亲和层析、TritonX-114洗涤、SuperdexG-25凝胶过滤层析、Q-SepharoseFF离子交换层析进行纯化。SDS-PAGE鉴定纯化蛋白,Lowry法检测蛋白浓度,37℃水浴孵育0～4h检测纯化蛋白的稳定性,鲎试剂法检测内毒素含量。结果:工程菌pET28a/HSP70/BL21在发酵表达3h后获得96g湿菌,其中相对分子质量约为70000的蛋白约占菌体总蛋白量的29.6%;表达产物纯化后在相对分子质量约70000处可见特异性条带,该分子质量蛋白约占总蛋白量的96.5%;纯化后蛋白浓度约1.2g.L-1;37℃水浴中放置4h后相对分子质量为70000的蛋白约占总蛋白量的95.1%;纯化产物内毒素含量<0.01EU.μg-1。结论:成功表达、纯化了重组BCGHSP70,并有效地去除了其中的内毒素。

脂质体介导哺乳动物细胞转染的改良方法

目的提高脂质体介导的细胞转染效率。方法在传统的脂质体生化转染过程中,介入了简单的物理转染技术,并应用有限稀释克隆技术和共聚焦荧光显微镜检测技术,对转染细胞进行了早期克隆筛选,用流式细胞术对转染细胞表达GFP的阳性率进行检测。结果流式细胞术检测显示,通过改良法获得转染pcDNA3-GFP-PSA质粒的B16、RM1和EL4细胞,表达报告蛋白GFP的阳性百分率(26%、24%和40%)高于传统法转染的细胞(16%、16%和18%)。改良法转染的B16、RM1和EL4经过克隆筛选、液氮冻存、水浴复苏和体外连续培养2周后,外源基因报告蛋白GFP表达的阳性百分率分别为77%、69%和83%。在转染流程上,通过改良法获得单克隆转染细胞株的时间明显缩短。结论改良的脂质体转染方法结合细胞克隆技术,能在最短时间内获得高表达外源基因的转染细胞株。

人酸性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌的高效表达

目的 :探讨人酸性成纤维细胞生长因子 (acidic fibroblast growth factor,a FGF)在大肠杆菌中高效表达的方法及重组人 a FGF的生物学活性。方法 :1通过 PCR法扩增人 a FGF引入点突变 ,对其密码子进行改造 ;2构建 a FGF- p ET- 2 8a重组质粒并在大肠杆菌 BL2 1 (DE3)中表达 ;3重组蛋白的纯化及生物学活性研究。结果 :通过 PCR扩增 ,将设计的核酸水平突变引入到 a FGF DNA中 ,使其自起始密码 ATG后的前 5 0个碱基均为原核细胞偏爱密码子、并保持原氨基酸序列不变 ,成功地实现了重组人 a FGF在大肠杆菌中的高效表达 ,并通过降低培养温度使大肠杆菌中可溶性目的蛋白的含量大幅增加 ,原核表达的 a FGF亦具有天然生物学活性。结论 :通过对 a FGF DNA碱基进行改造 ,可大幅度提高 a FGF在大肠杆菌中的表达量 。

重组人乳头瘤病毒CTL表位疫苗的构建与表达

目的:构建人乳头瘤病毒的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位疫苗并在大肠杆菌中表达。方法:应用多轮PCR的方法合成CTL表位基因序列,将其亚克隆入pET28a表达载体中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白质,用Western blotting对重组蛋白进行鉴定。结果:采用计算机表位预测的方法选取HPV6、11、16型的CTL表位,通过5轮PCR人工合成人乳头瘤病毒CTL表位疫苗的基因片段HPVepi,用亚克隆的方法构建了重组表达质粒pET28a-Tat-HPVepi,并在大肠杆菌高效表达了该重组蛋白质,经Western blotting鉴定显示出特异性条带。结论:结合计算机表位预测和PCR的方法构建并在大肠杆菌中高效表达了一种人乳头瘤病毒CTL表位疫苗。

Ⅱ型碳酸酐酶对破骨细胞性骨吸收的影响

目的 :研究破骨细胞分泌的 型碳酸酐酶对骨吸收过程的影响。方法 :由 1日龄 SD大鼠四肢长骨分离破骨细胞 ,并接种于象牙骨片上共同培养 ,在培养液中分别加入不同浓度的 型碳酸酐酶阻断剂乙酰唑胺 ,在第 3天和第 9天时观察破骨细胞骨吸收能力 ,以证实 型碳酸酐酶对破骨细胞性骨吸收的影响。结果 :1 0 - 6 m ol· L- 1 乙酰唑胺使骨吸收陷窝数和吸收面积均显著减少 ,浓度为 1 0 - 8mol· L- 1 时只对骨吸收面积有显著抑制作用。结论 : 型碳酸酐酶通过调整破骨细胞内 p H值 ,影响破骨细胞的分化、成熟及活化进而影响骨吸收。

重组人酸性成纤维细胞生长因子对糖尿病大鼠难愈性皮肤溃疡的促愈合作用

目的:研究外用大肠杆菌表达的重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)对糖尿病大鼠难愈性创面的促愈合作用。方法:雄性Wistar大鼠10只,制备糖尿病大鼠难愈性皮肤溃疡模型;创面局部分别用rhaFGF(90U.cm-2)及生理盐水喷洒;记录创面面积、伤腔容积及愈合时间,观察创面肉芽组织生长及再上皮化,评价创伤修复情况。结果:与生理盐水对照组比较,rhaFGF组伤后各时间点的创面面积、伤腔容积均明显缩小(P<0.05),愈合率显著提高(P<0.05),创面愈合时间明显缩短(P<0.05)。rhaFGF组的肉芽组织生长及再上皮化明显加速。结论:局部应用大肠杆菌表达的rhaFGF对糖尿病大鼠难愈性创面有明显的促愈合作用。

卡介苗作为抗肿瘤重组蛋白疫苗佐剂的研究

目的:探讨卡介苗(BCG)能否增强抗肿瘤疫苗HSP-MUC1的特异性抑瘤作用,从而将BCG开发为肿瘤疫苗的新型佐剂。方法:动物水平上,BCG和HSP-MUC1共免疫小鼠,观察BCG能否增强HSP-MUC1所激发的特异性抑瘤作用。细胞水平上对BCG发挥佐剂作用的机制进行探讨,将BCG和HSP-MUC1共刺激树突状细胞(DC),观察BCG能否协同HSP-MUC1刺激DC表面的CD86分子表达的上调;并对DC培养上清中IL-6、TNF-α的水平进行测定。结果:BCG+HSP-MUC1组小鼠的肿瘤重量显著地低于HSP-MUC1组(P<0.05)。细胞学试验显示,BCG能够显著增强HSP-MUC1对DC的激活作用,使DC表面的CD86分子显著上调。BCG+HSP-MUC1组的DC培养上清中细胞因子IL-6、TNF-α的水平显著地高于HSP-MUC1组(P<0.05)。结论:BCG能够显著地增强HSP-MUC1的抗肿瘤活性,具有肿瘤疫苗佐剂的良好功效。

HIV-1Tat基因的融合构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的: 在E.coliBL21(DE3)中高效表达Tat蛋白。方法: 用PCR方法构建HIV- 1Tat基因全序列, 同时将Tat基因进行定点突变(AAG28替换为CAG, AAG50替换为CAG),以消除天然Tat蛋白的转录活性。将突变的Tat基因与伴侣10(chap10)基因连接后, 共同亚克隆入表达载体pET28a中,并在E.coli中表达, 表达产物用Westernblot进行鉴定。结果: 分别通过 3轮PCR, 成功地构建了Tat基因全序列。构建的重组质粒pET28a- chap10 Tat在E.coliBL21(DE3)中得到高效表达。Westernblot分析表明, 在相对分子质量 (Mr)为24 000处有 1条特异性的带。结论: chap10基因与HIV- 1Tat全基因的融合构建, 使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为其在爱滋病发病中作用研究奠定了基础。

实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价

目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法，为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区，依据双歧杆菌的16 SrRNA序列共设计3条引物，以常规 PCR扩增出的16 SrRNA部分基因片段制作标准品，应用 SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料，对连续稀释的标准品及待测样本进行分析，建立绝对定量的标准曲线，同时计算出待测样本双歧杆菌浓度；根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度；分析 PCR产物熔解曲线评价反应特异性；重复检测梯度稀释的标准品，用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp，测序结果正确，成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品；生成的标准曲线R2＝0.999，最低检测限度为每个反应1.48＆#215;102个拷贝；实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量 PCR检测，各组间每微升1.48×10^3～1.48×10^7个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94％、3.39％、3.54％、3.08％和3.34％。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数·-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量 PCR法敏感性高、特异性强，且重复性好，适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。