以临床问题为导向的分子生物学综合性实验探索

随着医学的发展,越来越多将分子生物学的理论与技术,应用于疾病的预防、诊断和治疗。从分子水平探讨各种疾病的发生发展的机制,已成为当代医学研究的共同目标。因此作为一名医学院校的学生,掌握与应用分子生物学实验技术,结合临床实践,在分子水平上认知、诊断各种疾病的发生发展机制是十分必要的。改革与优化实验课教学体系,更新实验课教学内容,有利于提高实验教学质量,培养高素质医学人才,在实验教学中培养学生创新意识、训练学生创新能力、培养学生创新品质。

改革医学七年制生物化学实验教学,培养创新型人才

为提高医学七年制学生的综合素质,培养具有厚基础、宽口径,强能力、高素质的有创新能力的医学人才,从实验教学内容、教学手段、课程设置、安排以及实施等方面入手,对生物化学实验课进行了大胆的改革,并取得了一些成功的经验.

建设高水平开放性创新实验室,加强医学院校学生创新能力的培养

高等院校实验室是进行实验教学及科学研究活动的重要载体,是培养学生创新精神,挖掘其潜能的关键平台。如何充分利用现有资源,激发学生的创新意识、有效地加强和提高其创新能力,是一个亟待解决的突出问题。近年来,我校对实验室建设工作高度关注,常抓不懈,不断强化实验教学环节,多项举措卓有成效。我国高校在实验教学过程中不断探索关于如何造就复合型、创新型人才的途径,开放实验室是这一过程所形成基本共识的核心要素[1]。

抗重组人白细胞介素12单克隆抗体的制备及其生物学特性

目的:以纯化的重组人白细胞介素12(rhIL-12)蛋白为抗原,制备具有生物活性的rhIL-12单克隆抗体(McAb),并对其特性进行研究鉴定,为肿瘤及免疫相关性疾病的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。方法:以纯化的rhIL-12p70免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术,用间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及多次克隆化,培养制备杂交瘤细胞系,用clutathione sepharose 4B进行纯化。采用间接ELISA及Western blotting等方法对McAb的Ig亚类(型)腹水效价及特异性进行鉴定。结果:建立了3株持续分泌rhIL-12p70McAb的杂交瘤细胞株,3株细胞染色体数目均为100条左右,证实为杂交瘤细胞,所分泌的抗体为2株IgG1亚类及1株IgG2a亚类,轻链属k型,小鼠腹水效价测定分别为1∶5.9×106、1∶2.9×107、1∶3.6×107,亲和力依次为EM5>EM6>EV9。结论:成功地制备了3株能稳定分泌抗rhIL-12p70的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高。

褐藻多糖硫酸酯对老龄小鼠抗氧化酶活性的实验研究

目的研究褐藻多糖硫酸酯(APS)对老龄小鼠超氧化物歧化酶(SOD)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)丙二醛(MDA)的影响。方法化学发光法测定SOD活性,比色分析法测定GSH-px活性及MDA含量。结果老龄小鼠多糖APS组脑、肾、心SOD、GSH-px活性升高,与对照组比较差异显著(P<0.01,P<0.05),肝组织无差异。多糖APS组脑、肾、心MDA含量降低,与对照组比较差异显著(P<0.05),肝组织无差异。结论APS能够提高老龄小鼠SOD、GSH-px活力,降低MDA含量,具有一定清除自由基作用。

益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠丝裂原和应激激活蛋白酶1表达的影响

目的通过分析丝裂原和应激激活蛋白激酶1(MSK1)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的表达情况探讨中药复方益肾达络饮保护小鼠损伤脑组织的机制。方法利用蛋白印迹技术,检测小鼠脑组织中MSK1、CREB的含量。结果脑组织中MSK1表达显示,正常组和中药组、激素组、抑制剂组均有显著性差异(均P<0.01);模型组和抑制剂组有显著性差异(均P<0.01);中药组和激素组、抑制剂组有显著性差异(P<0.01);中药组和模型组、中药加激素组有差异(均P<0.05)。CREB表达显示:中药组CREB的表达与其余各组相比均显著升高(P<0.01);中药组、中药加激素组和激素组的CREB水平依次降低。结论复方益肾达络饮治疗EAE与MSK1升高有关,p38MAPK信号通路下游因子MSK1表达与其底物CREB表达呈相同态势。

益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠CREB、P-CREB表达的影响

目的观察中药复方益肾达络饮治疗的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠中枢神经系统中c AMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平,探讨其对小鼠中枢神经损伤的可能作用机制。方法建立小鼠EAE动物模型,采用蛋白免疫印迹技术检测正常对照组、模型组、中药组、激素组、中药加激素组、抑制剂组小鼠脑和脊髓中CREB、P-CREB的表达量,并计算CREB磷酸化水平(P-CREB/CREB)。结果在脑组织中,中药组P-CREB相对表达量及CREB磷酸化水平(P-CREB/CREB)与其余各组比较均显著升高(P<0.01);中药组、中药加+激素组和激素组CREB磷酸化水平依次降低(两两比较P<0.01)。在脊髓组织中,中药组P-CREB相对表达量均高于模型组(P<0.01)、对照组(P<0.05)和抑制剂组(P<0.05);中药组、中药+激素组及激素组CREB磷酸化水平均高于模型组(P<0.05),这3组之间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论益肾达络饮对EAE的治疗作用可能与升高CREB的磷酸化水平有关。

阿托伐他汀对家兔动脉粥样硬化血管细胞粘附分子-1基因表达的影响

目的探讨家兔动脉粥样硬化病变中血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达和阿托伐他汀的抗动脉粥样硬化作用。方法24只大耳白兔随机分为常规饲料组、胆固醇饲料组和阿托伐他汀组,饲养16周。实验前后检测(血清胆固醇TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL),采用免疫组化和逆转录多聚酶链式反应(PCR)方法测定主动脉壁VCAM-1阳性表达百分比和mRNA的表达。结果阿托伐他汀显著降低TC和LDL水平(P<0.01)。胆固醇饲料组和阿托伐他汀组病变局部VCAM-1的阳性染色百分比和mRNA的表达量明显高于对照组(P<0.01),但阿托伐他汀组动脉粥样硬化病理改变较胆固醇饲料组明显减轻,VCAM-1阳性染色百分比及mRNA的表达量较胆固醇饲料组明显降低(P<0.01)。结论动脉粥样硬化的发生伴有血管细胞粘附分子的高度表达。阿托伐他汀不但有调脂作用,而且具有抑制粘附分子和抗动脉粥样硬化的作用。

组织胚胎学固有结缔组织实验课教学的改革与探索

组织学与胚胎学是医学相关专业必修的一门重要的专业基础课,它在基础医学与临床医学间起到桥梁学科的作用。因为组织学与胚胎学是在一年级下学期授课,是医学新生最先接触的医学基础课,它给新生带来大量的生活中接触不到的专业医学词汇,即抽象又枯燥,特别是对于医学理科生,他们失去了逻辑推理和思维,甚至有的学生为此而退学,所以如何提高医学新生的学习兴趣和积极性,是我们桥梁基础医学课的关键,也是我们实施教学改革的方向标。

实验性角膜非特异性炎症反应的病理形态学研究

目的 探讨非特异性角膜炎症反应中朗格罕氏细胞(LC)形态的成熟与角膜炎症细胞浸润的相关性。方法 建立BALB/C鼠角膜缝线及合并结膜下药物注射的动物模型,观察各组角膜术后1、3、7、1 4d临床、病理组织学改变,及不同时相点各组角膜中央LC的数量、形态。结果 缝线组和结膜下细菌脂多糖(LPS)注射组角膜炎症细胞浸润,角膜中央LC的数量、树突状突起均明显高于对照组和合并NF- kB抑制剂四氢吡咯-二硫代氨基甲酸酯(PDTC)结膜下注射组。结论 角膜非特异性炎症反应程度可能与LC的成熟与否有关,LC形态的成熟可部分被核因子NF- Kb抑制剂PDTC所阻断。

动脉粥样硬化与血管细胞黏附分子-1基因表达关系的研究

目的探讨动脉粥样硬化(AS)与血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)基因表达的关系。方法16只大耳白兔随机分为常规饲料组(对照组)和胆固醇饲料组,饲养16周建立AS模式。饲养前后检测兔血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)浓度。取主动脉行病理学检查。采用免疫组化(S-P法、DAB染色)和逆转录多聚酶链式反应(PCR)方法测定主动脉壁VCAM-1阳性表达百分比和mRNA的基因表达。结果0周两组动物TC、TG、LDL差别无显著性(P>0.05),胆固醇饲料组饲养8周及16周后血清TC、LDL较0周明显升高(P<0.01),并且明显高于对照组(P<0.01)。胆固醇饲料组主动脉可见动脉粥样斑块形成,病变局部VCAM-1的阳性染色百分比和mRNA的表达量均明显高于对照组,分别为(18.38±2.55)%和(2.92±0.31)%及1.116±0.017和0.684±0.006(P<0.01)。结论AS的发生伴有VCAM-1的过度表达,这种过度表达可能与AS病变的发生发展具有一定关系。

黄蘑多糖Fb对小鼠免疫功能的调节作用

目的:研究黄蘑多糖Fb(polysaccharid Fb from Huangmo)对小鼠免疫功能的调节作用。方法:健康成年小鼠40只,随机分为对照组、环磷酰胺(CTX)免疫抑制组、黄蘑碱溶性多糖活性组分(Fb)正常小鼠给药组和Fb环磷酰胺伍用(M)给药组,采用NK细胞介导的细胞毒试验测定自然杀伤细胞(NK)的活性,淋巴细胞转化试验测定T淋巴细胞增殖功能,鼠脾T淋巴母细胞增殖分析法测定白细胞介素2(IL-2)的活性,观察Fb对各组小鼠免疫指标的影响。同时通过明胶酶谱分析检测脾脏基质金属蛋白酶(MMPs)的表达。结果:黄蘑多糖Fb能提高免疫抑制小鼠的NK细胞活性,T淋巴细胞转化率(LTT)和IL-2的活性(P<0.05),对正常小鼠LTT有显著促进作用(P<0.01)。正常给药组和伍用组主要免疫器官脾脏和胸腺重量高于免疫抑制组,且小鼠体重增长也明显高于免疫抑制组(P<0.01);免疫抑制组小鼠脾脏MMP-2活性下降(P<0.05),MMP-9亦呈降低趋势(P>0.05),Fb组和M组MMP-9活性明显升高(P<0.01)。结论:黄蘑多糖Fb能提高免疫抑制小鼠免疫系统的活性并有可能保护和促进其免疫系统的修复和增生,显著提高正常小鼠T淋巴细胞转化率,其他免疫指标亦显示轻度上调作用。

自动电位滴定法和高效液相色谱法测定深颜色果蔬中维生素C浓度的比较

目的：探讨应用自动电位滴定法和高效液相色谱（HPLC）法定量测定深颜色果蔬中维生素C（Vc）浓度的可行性，为少量或批量果蔬样品Vc浓度的测定提供方法依据。方法：选取市售的15种蔬菜和15种水果的可食部分，加入一定量的草酸做Vc保护剂进行匀浆、过滤、离心处理，取一定量的上清液分别对其中的Vc浓度进行自动电位滴定和HPLC分析，对于同一红柿椒样品，分别用2种分析法对样品的Vc浓度进行准确度和精确度的测定。结果：2种分析法检测30种果蔬中Vc的浓度差异无统计学意义（P〉0．05），电位法对红柿椒中Vc浓度测定的回收率为98．34％～103．98％，HPLC法对Vc浓度测定的回收率为99．66％～101．49％；电位法测定红柿椒中Vc的相对标准偏差（RSD）为1.77％～2．88％，HPLC法测定Vc的RSD为0．15％～0．32％，且HPLC法线性关系良好（R^2=0．9999）。结论：2种分析法对深颜色果蔬样品中Vc浓度测定的准确度和精密度均能满足定量分析的要求，均为较理想的测试方法。

成年糖尿病大鼠重要器官组织SOD、MDA含量变化

目的研究成年糖尿病大鼠重要器官组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量变化。方法测定对照组(C)、胰岛素治疗糖尿病组(ID)、糖尿病组(D)大鼠重要器官组织SOD活力、MDA含量。结果大鼠心、肝、肺、脾、胰组织D组与C组比较,SOD活力下降(P<0.05、P<0.01),肝、脾、胰组织ID组与C组比较,SOD活力下降(P<0.05),肺D组与ID组比较,ID组SOD活力提高(P<0.05),肾组织SOD活力无变化;D组心、肺、胰、脾组织中MDA含量升高,与C组比较,有显著差异(P<0.05,P<0.01);ID组心、胰、脾组织MDA含量与C组比较有显著差异(P<0.05,P<0.01),心、脾组织MDA含量ID组与D组比较,有显著差异(P<0.05,P<0.01),肝、肾组织MDA含量无变化。结论糖尿病大鼠重要器官组织抗氧化酶水平低下,经胰岛素治疗后,有提高趋势。

MTHFR基因C677T多态性与习惯性流产的关联性分析

目的：探讨亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T多态性与中国东北地区人群习惯性流产的关系,阐明其可能发生的分子基础,为该病基因诊断及易感人群的预防、治疗和预后提供新思路。方法：应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测50例有生育史健康妇女（对照组）和56例习惯性流产女性（病例组）的MTHFR基因C677T多态性。结果：MTHFR基因C677T存在CC、CT和TT3种基因型。病例组CC、CT和TT基因型频数分布与对照组比较差异有显著性（χ^2=6.254,P=0.044）,TT与CC基因型频数分布比较差异有显著性（χ^2=6.345,P=0.012）,TT与CT基因型频数分布比较差异无显著性（χ^2=2.099,P=0.147）。病例组T等位基因频数分布与C等位基因频数分布比较差异有显著性（χ^2=7.054,P=0.008,OR=2.098,95%CI：1.210~3.636）。结论：MTHFR基因C677T多态性与中国东北地区人群习惯性流产有关联,T等位基因可能是习惯性流产遗传易感因素之一。

东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ对肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ对肝癌细胞凋亡的影响及其诱导凋亡的初步机制。方法:将人肝癌细胞株Hep G2浸润在不同浓度的蝎毒多肽组分Ⅲ溶液中,应用DNA凋亡梯状带分析法和DNA末端转移酶介导的末端标记法(TUNEL法)测定凋亡的发生及凋亡率;用Western blotting方法观察Bcl-2蛋白和Caspase-3的表达量。结果:蝎毒多肽组分Ⅲ引起的肝癌细胞株Hep G2凋亡呈剂量依赖性变化。DNA凋亡呈现明显的梯状带电泳行为。经5、10、50、100及200 mg.L-1蝎毒多肽组分Ⅲ处理12 h后,肝癌细胞凋亡率分别为(6.1±3.0)%、(15.3±4.9)%、(48.5±5.2)%、(66.7±6.5)%和(91.2±6.9)%。凋亡伴随着bcl-2基因的表达下调,在凋亡过程中Caspase-3被激活。结论:东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ可以促进人肝癌细胞株Hep G2的凋亡,并且这种凋亡可能与通过下调bcl-2基因和激活Caspase-3途径有关。

再生障碍性贫血患者外周血和骨髓中IL-17、IL-23及TGF-β表达水平及其临床意义

目的:探讨再生障碍性贫血(AA)患者外周血和骨髓中白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素23(IL-23)及转化生长因子β(TGF-β)的表达水平及其临床意义,阐明AA的发病机制。方法:随机选取50例AA患者作为实验组,30例同期体检健康人作为对照组;采用酶联免疫吸附法(ELISA)和实时荧光定量PCR法检测外周血、骨髓中IL-17、IL-23、TGF-β蛋白及mRNA表达水平。结果:与对照组比较,实验组患者外周血、骨髓中IL-17和IL-23蛋白及mRNA表达水平明显升高,组间比较差异有统计学意义(P<0.01),其中以IL-17升高最为显著(P<0.001);实验组患者外周血和骨髓中TGF-β蛋白及mRNA表达水平明显降低,组间比较差异亦有统计学意义(P<0.01)。实验组患者外周血和骨髓中IL-17与IL-23蛋白表达水平均呈正相关关系(r=0.69,P<0.05;r=0.71,P<0.05),IL-17与TGF-β蛋白表达水平呈负相关关系(r=-0.65,P<0.05),IL-23与TGF-β蛋白表达水平呈负相关关系(r=-0.72,P<0.05)。结论:IL-17、IL-23和TGF-β可能直接参与AA的发生发展过程,三者的联合检测可为AA患者的临床治疗提供新的思路。

乌司他丁对多器官功能衰竭大鼠肝、肾组织氧自由基水平的影响

目的探讨内毒素致大鼠多器官功能衰竭(MOF)时,肝、肾组织超氧化物歧化酶(SOD)丙二醛(MDA)的变化及乌司他丁(u linasta-tin)对肝、肾组织的保护作用。方法一次性舌下静脉注射大肠杆菌内毒素(LPS),复制出大鼠MOF模型,在实验后2 h、6 h分别测定大鼠肝、肾组织SOD活性和MDA的含量。结果大鼠MOF时,肝、肾组织中SOD活性较对照组降低(P<0.01),MDA含量较对照组升高(P<0.01,P<0.05)。而注射乌司他丁后,大鼠肝、肾组织6 h组与MOF组比较SOD活性有所升高(P<0.01),MDA含量下降(P<0.01,P<0.05)。结论内毒素致MOF时体内SOD和MDA变化是导致大鼠肝、肾组织功能损伤的原因之一,而乌司他丁对大鼠肝、肾组织有一定的保护作用。

黄蘑多糖对衰老模型小鼠单胺类神经递质的影响

目的探讨黄蘑多糖对D-半乳糖(D-gal)致衰老模型小鼠单胺类神经递质的影响。方法用D-gal诱导致衰老模型小鼠,以黄蘑多糖Fb-2b灌服6w后,用荧光法检测去甲肾上腺素,多巴胺,5-羟色胺,5-羟吲哚乙酸含量变化。结果黄蘑多糖能明显提高D-gal致衰老模型小鼠脑组织中单胺类神经递质含量,其中,中剂量、大剂量组作用显著(P<0.05,P<0.01)小剂量组作用不明显。结论黄蘑多糖Fb-2b有明显的抗衰老作用。

常染色体DAZL基因单核苷酸多态性与男性不育相关性研究

目的:探讨常染色体DAZL基因单核苷酸多态性(SNP)与男性不育的关系。方法:收集东北地区男性不育症患者(不育组,n=144)和健康并已育有一子女的男性(生育组,n=53)精液标本,不育组按照WHO(1999)少、弱和畸形精子分类标准分成少弱畸形精子症组(n=17)、少弱精子症组(n=33)、弱畸形精子症组(n=13)、弱精子症组(n=54)和非少弱畸形精子不育症组(n=27),应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)筛选SNP260多态性,应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)筛选SNP386多态性,并测序验证和进行统计学分析。结果:不育组及生育组中均检测到SNP260A→G多态性,统计学分析差异无显著性(P>0.05),但在少弱畸形精子症组SNP260AG基因型比例大于其他各组;各研究组均未发现SNP386多态性。结论:SNP260和SNP386多态性与中国东北地区男性不育无相关性。前者AG基因型与少弱畸形精子的关系尚需进一步证实;后者多态性可能仅分布在台湾的一些狭小地区,两者均不能作为东北地区男性不育基因诊断的分子标志。