c-kit-D816V稳定表达细胞系的构建及药物筛选

目的建立过表达人干细胞因子(stem cell factor,SCF)受体c-kit基因突变小鼠红白血病HCD57细胞株,以应用于抗癌小分子药物筛选。方法以带有人c-kit-D816V基因突变质粒为模板,设计并合成引物,PCR扩增c-kit基因,逆转录病毒载体用限制性内切酶EcoRⅠ进行单酶切,采用同源重组法构建pMSCV-c-kit-D816V表达载体。采用酶切和基因测序对重组质粒进行鉴定。利用Lipofectamine 3000将重组质粒和辅助质粒共转染GP2-293细胞进行病毒包装。在荧光显微镜下观察转染效果,收集、浓缩病毒上清液。将制备好的逆转录病毒感染HCD57细胞,采用甲基纤维素半固体培养基筛选单克隆稳定转染细胞株,采用流式细胞术鉴定c-kit基因表达。采用CCK-8法进行小分子靶向药物筛选实验。结果酶切鉴定结果显示,电泳后重组质粒单酶切后可见约为693、2250和6488 bp大小的3条DNA条带,与载体及c-kit基因片段大小相符;DNA测序结果显示,c-kit基因成功插入到逆转录病毒表达载体中。流式细胞术检测结果显示,感染后的HCD57单克隆细胞株高表达C-kit蛋白。CCK-8细胞增殖实验显示,伊马替尼对HCD57-c-kit-D816V细胞的生长无明显抑制作用,帕博西尼、达沙替尼、艾德拉尼均对HCD57-c-kit-D816V细胞抑制作用明显。结论逆转录病毒载体介导C-kit蛋白稳定表达的HCD57细胞系构建成功,药物初筛实验成功,可用于抗癌小分子药物筛选实验。