口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3′NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段。方法以FMDV WFL株RNA为模板,用3′RACE法扩增出2C-P3-3′NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较。结果扩增的基因片段大小为4033bp,其2C、P3和3′NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87·11%～94·23%、84·91%～96·66%和66·98%～82·35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94·97%～99·39%和91·84%～98·55%,WFL株P3基因的第1150～1270、1680～1840和2080～2490bp以及2C基因的第354～470bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性。因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA。结论成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3′NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段。

小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶基因打靶载体的构建及鉴定

目的:对牙釉质丝氨酸蛋白酶(EMSP1)基因进行体外扩增,构建基因打靶载体,利用基因打靶技术建立转基因动物模型,研究EMSP1生理功能和病理学意义。方法:根据EMSP1的DNA序列,采用Oligo6.0软件设计两对引物,以129品系小鼠基因组DNA为模板,分别扩增长为5 000 bp和1 700 bp片段作为同源长短臂。将其分别插入通用型基因敲除载体pSSC-9的正向筛选基因neo两侧,用PCR方法、限制性酶切和DNA序列分析进行鉴定。结果:采用双酶切鉴定,阳性重组克隆分别切出5000 bp和1700 bp片段,表明长短臂已克隆于载体中。DNA序列分析表明,成功构建EMSP1基因打靶载体pSSC-9-EMSP1。结论:成功构建小鼠EMSP1基因打靶载体。