肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体的生物学特性

目的:分离并鉴定肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体,对其生物学特性进行研究,为开发抗肠出血性大肠埃希菌O157的生物制剂提供实验依据。方法:以肠出血性大肠埃希菌O157为宿主菌,采用噬斑法从环境污水中分离出针对肠出血性大肠埃希菌O157的噬菌体。噬菌体经超滤浓缩后,电镜观察其大小和形态;将宿主菌和噬菌体以不同的比例混合,测定噬菌体的最佳感染复数并观察其一步生长曲线;利用SDS-PAGE分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白;提取噬菌体基因组,进行酶切电泳分析。结果:电镜显示噬菌体的头部呈球形、直径40nm,噬菌体的尾部长约80nm。噬菌体的最佳感染复数为10-2,即当宿主菌和噬菌体之间的比例为1∶100时裂解效率最高。一步生长曲线示噬菌体在裂解宿主菌时,潜伏期约为10min,爆发期约为30min,裂解量为130。SDS-PAGE凝胶电泳呈现13种蛋白,相对分子质量为16 000～22 000。琼脂糖凝胶电泳显示噬菌体基因组大小约23 000bp。结论:成功分离并鉴定一株针对肠出血性大肠埃希菌O157的噬菌体,是一种裂解性强、特异性高的毒性噬菌体,肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体属于有尾病毒目,管尾噬菌体科。

鲍曼不动杆菌噬菌体生物学特性的研究

从污水中分离鉴定鲍曼不动杆菌噬菌体,并对其生物学特性进行分析,为开发针对细菌感染的噬菌体生物制剂提供前期工作。采用双层琼脂法分离可裂解鲍曼不动杆菌的噬菌体,通过负染法电镜观察噬菌体的大小和形态,将噬菌体和宿主菌以不同比例混合,测定噬菌体的最佳感染复数并观察一步生长曲线,提取噬菌体核酸进行酶切电泳分析,通过SDS-PAGE分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白。成功分离3株可裂解鲍曼不动杆菌的噬菌体(分别命名为ФAb-1、ФAb-2和ФAb-3),电镜显示噬菌体的头部呈二十面体,直径约50nm,有一短尾。噬菌体ФAb-1的最佳感染复数为10-2,一步生长曲线表明噬菌体在裂解宿主菌时,潜伏期为20 min,爆发期为30 min,裂解量为190 PFU/cell。限制性酶切电泳显示噬菌体ФAb-1的基因组大小约40 kb左右,为双股环状DNA。SDS-PAGE的噬菌体蛋白电泳包括7种蛋白,分子量在29～116 ku。噬菌体ФAb-1、ФAb-2和ФAb-3对鲍曼不动杆菌具有很强的裂解毒性。根据其形态、结构和噬菌体分类法,鲍曼不动杆菌噬菌体属于有尾病毒目,足尾病毒科。

132例临床真菌感染的病原学及流行病学分析

目的了解长春市中心医院1年间住院患者真菌感染现状及流行病学特征,为临床真菌感染的诊断、治疗提供参考。方法收集临床呼吸科、老年病科等真菌感染患者的痰、尿等标本,进行病原真菌的分离、鉴定,并分析流行病学特征。结果收集132份临床标本,主要来源于呼吸科(55.3%),以痰标本为主(96.2%)。共分离获得假丝酵母133株,其中白假丝酵母最多(66.2%),其次为热带假丝酵母(20.3%)。结论与其他科室相比,该医院呼吸道疾病患者发生真菌感染最多,以白假丝酵母为主。应高度重视院内真菌感染,积极开展病原学监测,以减少感染的机会。

电子基因微芯片在医学研究中的应用

基因芯片（DNAmicrochip）也称DNA微阵列（DNAmicroarray），是把火量基因探针或基因片段按特定的排列方式固定在芯片载体上，彤成致密有序的DNA分子点阵，按碱基互补配对原则与样品DNA杂交，然后通过计算机进行解读和分析获耿大量信息，实现对生物样品高效、平行地检测或医学诊断。由于具有高通量、快捷、便宜等优点，基因芯片在各个领域起着越来越重要的作用。

青年教师参与留学生医学微生物学实验教学的几点体会

青年教师结合自身参加留学生医学微生物学实验教学实践,从了解学生需求、教学内容设计、教学手段运用、生物安全管理以及课后交流反馈等方面,交流几点思考和体会,为留学生医学微生物学实验课全英文教学提供参考。

医学微生物学全英教学改革与探索

吉林大学白求恩医学院20年间对七年制硕士和留学生的医学微生物学英文教学进行了积极的改革与探索,可为高等医学院校的全英微生物教学和留学生教学提供参考。

真菌胞内蛋白质提取方法的建立

目的:研究不同的提取方法对白假丝酵母和茄病镰刀菌胞内蛋白质浓度、种类及数量的影响,为建立一种稳定可靠的真菌胞内蛋白质提取方法提供依据。方法:分别以白假丝酵母菌和茄病镰刀菌为研究对象,培养时间为36、48和72h,超声波工作时间为20s、3min、5min,10min,超声波功率为332.5和475.0 W,通过蛋白质浓度检测和SDS-PAGE蛋白质电泳分析,比较不同条件下提取的蛋白质浓度、种类及数量,观察不同因素对蛋白质提取效果的影响。结果:2株真菌均在培养36h时提取胞内蛋白质的浓度最大,白假丝酵母在功率332.5W、超声3min时得到胞内蛋白质的数量和种类最多,茄病镰刀菌在功率332.5W、超声10min时得到蛋白质的数量和种类最多。结论:使用超声波法与玻璃珠研磨法结合提取胞内蛋白质,从菌株的培养时间、超声波工作时间和功率3方面建立了真菌胞内蛋白质的最佳提取方法。

阴沟肠杆菌噬菌体ФEc53的分离及鉴定

目的:以14株阴沟肠杆菌为宿主菌,从环境污水中分离噬菌体,分析其生物学特性,鉴定其分型。方法:采用双层琼脂噬斑法分离并鉴定噬菌体。纯化后的噬菌体经负染法染色,通过电镜观察其大小和形态;提取噬菌体基因组,进行酶切电泳分析;通过裂解谱的分析,确认噬菌体的特异性和裂解宿主菌范围。结果:成功分离1株裂解性噬菌体,电镜显示噬菌体的头部呈球形,直径约60nm,尾部长约130nm。琼脂糖凝胶电泳显示其基因组约40 000bp,且含多种酶切位点。特异性实验显示其呈现较窄的宿主范围。结论:分离的阴沟肠杆菌噬菌体(命名为ФEc53)属于有尾病毒目,管尾病毒科,是一种特异性高、裂解性强的毒性噬菌体。

噬菌体疗法在耐药性细菌感染中应用的研究进展

细菌耐药性已成为全球性的公共卫生问题,特别是"超级细菌"成员的不断增加使针对细菌感染的抗生素疗法面临前所未有的挑战。最近,噬菌体疗法重新受到人们的关注,并取得一些重要研究进展。本文作者就早期噬菌体的研究情况、近年来噬菌体疗法在动物实验中的应用、临床试验的最新实例和噬菌体疗法的优势及局限进行综述。

临床白假丝酵母感染状况分析及药物敏感性

目的探讨医院内白假丝酵母感染现状及对常用抗真菌药物的敏感性,为临床真菌感染的治疗提供一定的理论依据。方法收集临床真菌感染患者标本,进行菌株的分离、鉴定。分析白假丝酵母标本的来源和科室分布情况,并采用CLSI颁布的微量稀释法进行药物敏感性实验。结果白假丝酵母所占比例高达72.2%,主要来源于呼吸内科(65.6%),以痰标本的真菌分离率最高(86.8%)。药物敏感性实验结果表明,白假丝酵母对两性霉素B(AmB)、氟康唑(FCZ)、5-氟胞嘧啶(5-FC)、伊曲康唑(ICZ)的敏感率依次为100.0%、92.7%、91.4%、64.2%;仅对ICZ表现为耐药,耐药率为1.4%,但药物依赖性敏感高达34.4%。结论临床医生应高度重视医院内真菌感染;根据药物敏感性实验结果,合理用药,既能提高疗效,又可预防耐药性的产生。

EGFR外显子19、21突变等位基因特异性PCR检测方法的建立

目的建立一种人表皮生成因子受体(EGFR)外显子19、21突变等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法根据EGFR外显子19、21野生型和突变型设计特异性引物,提取健康人和非小细胞肺癌患者血中有核细胞的基因组DNA作为模板,采用等位基因特异性聚合酶链式反应扩增EGFR外显子19、21突变基因。结果特异性引物可以扩增EGFR外显子19缺失突变的2种类型和外显子21的错义突变。结论等位基因特异性PCR法可以用于检测人EGFR外显子19、21突变。

长春地区部分医院革兰阴性杆菌氨基糖苷类修饰酶基因的检测

目的:分析长春地区部分医院革兰阴性杆菌氨基糖苷类修饰酶基因的分布和类型,为抗生素的合理应用提供依据。方法:通过琼脂稀释法筛选出阿米卡星与庆大霉素的耐药菌株,采用聚合酶链式反应及序列分析的方法检测耐药菌株所携带的氨基糖苷类修饰酶基因类型。结果:69株革兰阴性杆菌对阿米卡星与庆大霉素的耐药率分别为44.9%和87.0%,其中63株(91.3%)检出氨基糖苷类修饰酶基因,基因类型包括aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ和ant(2")-Ⅰ,阳性率分别为4.3%、81.2%、43.5%、33.3%和13.0%;而aac(6′)-Ⅱ基因为阴性。结论:本地区革兰阴性杆菌氨基糖苷类修饰酶基因主要以aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ和ant(2")-Ⅰ5种类型存在,其中以aac(3)-Ⅱ型氨基糖苷类修饰酶基因最为常见。合理应用氨基糖苷类抗生素对于降低细菌的耐药性具有重要意义。

烟曲霉基因组与致病机制

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是环境中普遍存在的丝状腐生真菌,也是重要的机会致病菌。随着免疫受损人群的增多,由烟曲霉引起的系统性感染发病率不断升高,已成为重症免疫受损患者死亡的主要原因之一。文章结合烟曲霉全基因组序列信息对烟曲霉感染过程、致病机制等做一概述。

烟曲霉不同菌株致病力差异的研究

目的通过筛选出致病力最强和最弱的菌株研究烟曲霉的致病机制。方法SPF级雄性ICR小鼠216只,体重(20±0.5)g。随机分9组,每组8只(感染组7组,阴性对照组和正常对照组各1组)。其中感染组和阴性对照组小鼠免疫抑制后,分别接种7株烟曲霉的孢子悬液和生理盐水。正常对照组不注射环磷酰胺和孢子悬液。每日观察小鼠的生存状态。对死亡小鼠和处死小鼠的脏器进行组织匀浆菌落计数和病理学检测。实验重复3次。通过比较生存率、中位生存期、平均体重、组织匀浆菌落计数和组织病理学变化等来比较烟曲霉的致病力差异。结果①感染组小鼠接种孢子悬液后,体重迅速下降。肺组织病理学检测观察到组织坏死,菌丝聚集;肺组织匀浆培养得到的菌株经分子生物学鉴定为烟曲霉。②阴性对照组小鼠体重下降速度较感染组慢,无死亡;肺组织病理学检测未见菌丝侵袭。③通过比较生存率、中位生存期、组织病理学变化等指标,从7株烟曲霉中筛选得到致病力最强和最弱的菌株(烟曲霉JLC50134和JLC30566)。结论不同烟曲霉菌株间存在致病力的差异。

长春地区部分医院革兰阴性杆菌16S rRNA甲基化酶基因的检测及其意义

目的:分析长春地区部分医院革兰阴性杆菌16S rRNA甲基化酶基因的分布和类型,为氨基糖苷类抗生素的合理应用提供依据。方法:采用琼脂稀释法筛选出阿米卡星与庆大霉素的耐药株,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增耐药菌株所携带的16S rRNA甲基化酶基因及其类型(armA、rmtB、rmtA、rmtC、rmtD和npmA),利用基因测序比对扩增基因序列并确定16S rRNA甲基化酶基因类型。结果:116株革兰阴性杆菌对阿米卡星和庆大霉素的耐药率分别为42.2%和75.0%,其中50株革兰阴性杆菌呈16S rRNA甲基化酶基因阳性(43.1%,50/116),其主要类型为armA和rmtB(检出率分别为12.1%和31.0%),而rmtA、rmtC、rmtD和npmA的检出率均为0。结论:长春地区革兰阴性杆菌16SrRNA甲基化酶基因主要以armA和rmtB 2种类型存在,是其导致氨基糖苷类抗生素高水平耐药的原因之一。

假丝酵母SSR-PCR反应体系的优化

目的建立假丝酵母SSR-PCR反应体系,确立最佳反应条件,为将该技术用于临床假丝酵母感染的快速鉴定奠定基础。方法根据引物Tm值设立退火温度梯度,确定适宜的退火温度。利用正交实验,对影响SSR-PCR反应体系的Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物等4种主要因素,进行优化。结果引物最适退火温度为51℃。假丝酵母最佳的SSR-PCR反应体系为:在25μl的PCR反应体系中加入Taq DNA聚合酶1.0 U、模板DNA为25 ng、dNTP为0.15 mmol.L-1、引物为0.5μmol.L-1。结论采用正交实验优化的SSR-PCR反应体系,操作简便,电泳条带清晰,多态性好,重复性强,可为进一步建立临床假丝酵母感染的快速鉴定提供借鉴。

奇异变形杆菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性分析

目的分离鉴定奇异变形杆菌噬菌体,并分析其生物学特性。方法以奇异变形杆菌为宿主菌,采用双层琼脂噬斑法从居民区生活污水中分离针对奇异变形杆菌的噬菌体;噬菌体经纯化后,通过负染法电镜观察其形态及大小;将噬菌体和宿主菌以10∶1的比例混合共培养,测定噬菌体的一步生长曲线;提取噬菌体核酸并进行酶切分析。结果共分离出4株噬菌体,分别命名为PrM-01、PrM-02、PrM-03和PrM-04,在双层琼脂平板上可形成圆形、透明、边界清晰、直径约2～3 mm的噬斑,经反复纯化后,其滴度范围在(1.2～2.3)×1012PFU/ml;电镜观察显示,噬菌体的头部呈二十面体立体对称,直径约40 nm,尾部长约30 nm;PrM-04的一步生长曲线表明,噬菌体在裂解宿主菌时,潜伏期为15 min,暴发时间为25 min,裂解量为3.2×104;酶切分析显示,其基因组大小约为26 000 bp,且具有EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ多个酶切位点。结论成功分离出4株针对奇异变形杆菌的噬菌体,其表现出特异性高、裂解性强的毒性噬菌体特征。

蜱传森林脑炎病毒非结构蛋白1原核表达载体的构建

目的:构建蜱传森林脑炎病毒(TBEV)非结构蛋白1(NS1)的原核表达载体,以期获得其高纯度的表达,为制备多克隆抗体及其功能的研究奠定实验基础。方法:根据目的基因序列设计PCR引物,利用基因重组技术构建原核表达载体pEASYTM-E1-NS1。将重组后质粒pEASYTM-E1-NS1转化至BL21细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后进行镍离子亲和纯化,利用Bradford法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE和Western blotting法分析融合蛋白的表达水平。结果:含TBEV NS1的原核表达载体pEASYTM-E1-NS1经诱导后,可获得以包涵体形式存在的融合蛋白,通过亲和纯化得到较高纯度的蛋白质。SDS-PAGE和Western blotting,在相对分子质量约40 000处有特异性蛋白条带。结论:成功构建重组pEASYTM-E1-NS1原核表达载体,获得高纯度的重组TBEV NS1的融合蛋白。

人乳头瘤病毒16型E7基因原核表达载体的构建及表达

目的:构建人乳头瘤病毒16型(HPV-16)E7基因原核表达载体,观察目的基因的蛋白表达。方法:人工合成HPV16E7基因核苷酸序列,利用特异性引物通过聚合酶链反应扩增HPV16E7基因,并克隆至pGEX-4T1原核表达载体,构建重组表达载体pGEX-4T1-HPV16-E7。将其转化到工程菌Rosetta后,经IPTG诱导表达,进行E7-GST融合蛋白的SDS-PAGE分析和Ni 2+-NTA亲和层析纯化。结果:E7基因PCR扩增产物和重组表达质粒的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,均可见300bp的目的基因条带。表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳和纯化后,在相对分子质量约36 000处有特异性表达带,与预期相符。结论:在原核系统中含E7基因的重组质粒可有效表达E7-GST融合蛋白。