维生素K_3通过下调mTOR信号途径而诱导HeLa细胞自噬

目的观察VitK3(维生素K3,vitaminK3)对HeLa细胞损伤过程中的自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达的影响。方法以HeLa细胞为研究对象,采用MTT检测细胞存活率,用Western blot方法检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达的变化和蛋白激酶B(PKB,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化-Akt/mTOR表达的变化。结果30μmol·L-1剂量以上的VitK3可明显抑制HeLa细胞的增殖(P<0.05)。VitK3作用12h后增加Beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白表达水平(P<0.05),降低磷酸化的Akt/mTOR的蛋白表达水平(P<0.05)。结论VitK3能明显抑制HeLa细胞增殖并具有诱导HeLa细胞发生自噬的作用,其机制可能与下调mTOR信号有关。

缺糖缺氧对经内质网应激途径诱导Hela细胞凋亡的影响

目的:体外构建肿瘤细胞缺糖缺氧(OGD)模型,观察缺糖缺氧应激条件对肿瘤细胞凋亡的影响及其机制。方法:利用平衡盐溶液EBSS取代细胞正常培养液构建缺糖模型,利用连二亚硫酸钠消耗培养基中氧构建缺氧模型;实验分为对照组、缺糖缺氧4、8和12 h组。MTT法检测各组细胞增殖率;Western blotting检测各组Hela细胞内质网应激和凋亡相关蛋白的表达水平;Hoechst染色检测各组细胞细胞核形态学改变。结果:与对照组比较,缺糖缺氧各组细胞增殖率明显下降(P<0.05);内质网应激相关蛋白GRP78表达水平明显升高,内质网应激相关凋亡信号蛋白CHOP和caspase-4活化片段蛋白表达水平明显升高(P<0.05);细胞内凋亡相关蛋白caspase-3活化片段表达水平(P<0.05);缺糖缺氧组细胞核出现核皱缩和核碎裂等凋亡形态学表现。结论:缺糖缺氧可以诱导Hela细胞发生凋亡,其凋亡可能是通过内质网应激介导。

自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧过程中的表达及其意义

目的探讨自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧(OGD)过程中的表达及其意义。方法将PC12细胞分为正常对照组、缺糖缺氧1、4和12h组。MTT法检测细胞存活率,Western印迹法检测各组PC12细胞中BECN1、Bcl-2及Bax蛋白的表达水平。结果与正常对照组相比,OGD1及4h组PC12细胞存活率下降(均P<0.05),BECN1蛋白表达升高,且Bcl-2/Bax比值升高;而与缺糖缺氧1和4h组相比,OGD12h组细胞存活率明显下降(P<0.01),BECN1蛋白表达及Bcl-2/Bax比值亦明显降低。结论自噬蛋白BECN1及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax参与了PC12细胞OGD损伤过程。在OGD早期,自噬起主要作用,并对OGDPC12细胞起一定的保护作用,随着OGD时间的延长,凋亡在其中占主导地位,促进凋亡蛋白表达,引起PC12细胞的死亡。

抑制ClC-3表达对顺铂诱导人卵巢癌SKOV3/DDP细胞凋亡的促进作用

目的:探讨抑制氯离子通道-3(ClC-3)基因表达对顺铂(DDP)诱导的人卵巢癌SKOV3/DDP细胞凋亡的促进作用,为卵巢癌的治疗提供实验依据。方法:转染pSH1-siRNA-ClC-3重组质粒至人卵巢癌SKOV3/DDP细胞,Western blotting方法检测转染重组质粒对ClC-3蛋白表达的影响;MTT法检测细胞增殖率;Western blotting方法检测凋亡相关蛋白细胞色素C(Cyt-c)及Caspase-3活化片段蛋白表达。结果:与SKOV3细胞比较,SKOV3/DDP细胞中ClC-3蛋白表达水平增加(P<0.05);转染pSH1-siRNA-ClC-3重组质粒后,SKOV3/DDP细胞ClC蛋白表达水平明显降低;ClC-3-siRNA联合DDP作用后,SKOV3/DDP细胞增殖率下降(P<0.05),Cyt-c和Caspase-3活化片段蛋白表达水平增加(P<0.05)。结论:pSH1-siRNA-ClC-3可有效抑制SKOV3/DDP细胞ClC-3蛋白的表达,并促进DDP诱导SKOV3/DDP细胞凋亡。

聚肌胞对小鼠前列腺癌内微血管的影响

目的探讨聚肌胞(polvriboinsine-polyribocyaidylic acid,polyI:C)对小鼠前列腺癌组织内血管生成的影响,初探其可能机制。方法将16只C57BL6/J纯系荷瘤小鼠按瘤重随机分为对照组和polyI:C组,分别瘤内注射生理盐水和polyI:C(每3d1次),用药7次后切除瘤灶。HE染色,镜下观察肿瘤组织组织形态学变化及血管分布情况。利用试剂盒检测肿瘤组织内NO水平。免疫组织化学染色,观察肿瘤组织eNOS、VEGF和AQP1蛋白表达情况。结果对照组和polyI:C组小鼠前列腺癌组织内的NO含量分别为(8.73±5.34)μmol和(1.22±0.77)μmol,两组比较差异有显著性(P<0.05)。免疫组化结果显示,对照组和polyI:C组的VEGF阳性染色前列腺癌细胞计数占同类肿瘤细胞的比例分别为(37.91±7.62)%和(9.64±2.90)%;C组的eNOS阳性染色前列腺癌细胞计数占同类肿瘤细胞的比例分别为(54.43±10.39)%和(22.00±8.07)%;AQP1平均值分别为(14.8±3.5)和(3.2±1.3),两组比较差异有显著性(P<0.05)。结论polyI:C可能通过下调小鼠前列腺癌组织中eNOS和VEGF蛋白的表达,抑制小鼠前列腺癌组织内血管的生成;通过影响组织内AQP1蛋白水平、减少NO生成和释放,影响血管内皮细胞的功能和肿瘤组织的微循环。

TGF-β1、wt-p53基因在前列腺癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨TGF-β1、wt-p53基因在前列腺癌组织中的表达并探讨其临床意义。方法应用免疫印迹技术检测正常前列腺、前列腺癌组织和癌旁组织中TGF-β1,wt-p53基因的表达。结果正常前列腺外腺和癌旁组织间的TGF-β1、wt-p53表达水平无差异(P>0.05);前列腺癌组织中TGF-β1和wt-p53表达,与正常前列腺组织和癌旁组织相比差异显著(P<0.01);已有远处转移灶的前列腺癌组织中TGF-β1和wt-p53表达,与无转移灶者相比差异显著(P<0.01)。结论TGF-β1和wt-p53基因与前列腺癌的发生和转移相关,并可能在前列腺癌的进展中起重要作用。因此,借助测定TGF-β1与wt-p53表达可辅助前列腺癌的诊断和评估预后。

自噬溶酶体抑制剂氯化铵促进维生素K3诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用

目的:探讨自噬溶酶体抑制剂氯化铵(NH4Cl)在维生素K3(VK3)诱导的HeLa细胞凋亡过程中的作用。方法:实验分为4组:正常对照组、30μmol/L VK3作用组、10 mmol/L NH4Cl作用组和30μmol/L VK3+10mmol/L NH4Cl联合作用组。MTT法检测细胞存活率;吖啶橙(AO)染色观察溶酶体膜通透性变化,单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察自噬泡的变化,BCECF-AM染色流式细胞术检测细胞浆pH变化,Hoechst 33342染色检测细胞核染色质凝聚状态及细胞凋亡率。结果:与对照组相比,单独应用NH4Cl对HeLa细胞无明显影响。VK3作用组He-La细胞存活率降低,AO染色荧光没有变化,细胞内出现自噬泡,细胞浆呈酸性,细胞核染色质凝聚,细胞发生凋亡。NH4Cl与VK3联合作用于HeLa细胞时,与单独应用VK3组相比,溶酶体通透性增加,细胞内自噬泡更加聚集,细胞浆酸性增强,细胞凋亡率明显增加。结论:自噬溶酶体抑制剂NH4Cl促进了VK3诱导的HeLa细胞凋亡,表明自噬可能在VK3诱导的HeLa细胞损伤过程中起到保护作用。

大鼠局灶性脑缺血脑皮质线粒体氯通道基因的表达

目的探讨线粒体氯通道蛋白/CLIC4在局灶性脑缺血损伤中的作用。方法应用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。RT-PCR检测脑皮质CLIC4和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达;Western印迹方法检测脑皮质CLIC4的蛋白水平。结果与假手术组相比,缺血模型大脑皮质缺血侧CLIC4及iNOS的mRNA明显增高,CLIC4蛋白水平亦增加,而缺血模型正常侧大脑皮质CLIC4 mRNA及蛋白表达均降低。结论CLIC4可能参与脑缺血引起的神经细胞损伤。

结肠安栓联合舒血宁对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及其机制

目的:探讨结肠安栓联合舒血宁对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎(UC)的治疗作用,阐明其活血、抗炎和调节免疫的作用机制。方法:将64只Wistar大鼠随即分为空白组(n=8),模型组(n=8),美沙拉嗪组(0.380g.kg-1,n=8),舒血宁组(1.8 mL.kg-1,n=8),结肠安栓A、B组(1.215 g.kg-1,2.430g.kg-1,n=8),联合给药A组(结肠安栓1.215g.kg-1+舒血宁1.8mL.kg-1,n=8)和联合给药B组(结肠安栓2.430g.kg-1+舒血宁1.8mL.kg-1,n=8)。采用TNBS诱导大鼠UC模型,造模后连续给药14d,进行一般症状学观察,测定大鼠体质量、血液指标、淋巴细胞增殖能力,RT-PCR法检测IFN-γ和TNF-αmRAN水平,应用HE染色和免疫组织化学染色法观察大鼠结肠组织病理形态学变化和脾脏组织中CD4+表达。结果:与模型组比较,联合给药组UC大鼠的症状改善,体质量恢复;血小板(PLT)数量明显降低(P<0.05,P<0.01),血浆凝血酶原时间(PT)和延长部分凝血活酶时间(APTT)明显延长(P<0.05,P<0.01),3种炎细胞数量均有降低,IFN-γ和TNF-αmRNA表达水平明显降低,淋巴细胞刺激指数(SI)明显增高(P<0.01)。病理组织学染色,模型组大鼠结肠黏膜病理损伤最为严重,结肠黏膜可见糜烂、溃疡形成,有大量炎细胞浸润。联合给药组大鼠结肠黏膜溃疡黏膜上皮部分修复,腺体排列相对整齐,杯状细胞破损少,炎细胞浸润相对减轻。免疫组织化学染色,联合给药组大鼠脾脏组织中CD4+免疫反应阳性细胞数明显减少。结论:结肠安栓联合舒血宁对UC有治疗作用,其机制可能是活血、调节免疫从而减轻炎症反应。

抑制氯通道CLCN2基因表达对顺铂诱导胶质瘤U251细胞损伤的影响

目的:探讨使用特异性CLCN2反义寡核苷酸抑制CLCN2基因表达对顺铂诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤的影响。方法:U251细胞按处理方法不同分4组,对照组(转染无义寡核苷酸)、转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组(无义寡核苷酸与顺铂联用)、CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组。应用MTT法检测U251细胞生存率;RT-PCR检测CLCN2、cyclinD1 mRNA表达;TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:与对照组相比,转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组和CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组U251细胞生存率、CLCN2 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加;与顺铂组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组细胞生存率(P<0.05)、CLCN2、cyclinD1 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加(P<0.01);与CLCN2反义寡核苷酸组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组CLCN2 mRNA表达明显降低(P<0.01)。结论:①转染CLCN2反义寡核苷酸能有效抑制CLCN2 mRNA表达;②抑制CLCN2 mRNA表达能促进顺铂对U251细胞的损伤作用;③CLCN2基因表达降低参与顺铂对U251细胞损伤作用。

20(s)-原人参二醇对体外培养Siha细胞caspase-3表达激活的影响

目的:观察20(s)-原人参二醇(PPD)对体外培养人宫颈癌Siha细胞中caspase-9和caspase-3转录表达的影响,以及caspase-3的活化形式cleaved caspase-3含量的变化,阐明其诱导Siha细胞凋亡的机制。方法:体外培养人宫颈癌Siha细胞,将其分为阴性对照组(乙醇)和实验组(20μg.L-1 PPD),分别用乙醇和PPD处理体外培养的宫颈癌Siha细胞,48h后流式细胞仪检测细胞的凋亡峰,半定量RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学染色方法检测PPD处理后Siha细胞中caspase-9和caspase-3基因的转录与表达水平。结果:与阴性对照组比较,20μg.L-1 PPD处理48h后,Siha细胞凋亡率增加(P<0.05),Siha细胞中caspase-9与caspase-3转录水平升高(P<0.01),表达上调(P<0.01),caspase-3的活化形式cleaved caspase-3含量增加(P<0.01)。细胞免疫化学检测可见实验组细胞出现棕色颗粒。结论:PPD可促进人宫颈癌Siha细胞凋亡,其机制与激活caspase家族级联反应有关。

STAT3蛋白在前列腺癌患者前列腺组织中的表达和意义

目的探讨信号传导子及转录激活子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)蛋白在前列腺癌中的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学SP法检测29例正常前列腺组织和38例前列腺癌中STAT3蛋白表达情况。结果STAT3蛋白在高[25%(3/12)]、中分化前列腺癌组织中的表达[31.25%(5/16)]明显弱于在低分化前列腺癌组织[80%(8/10)](P<0.01)。结论STAT3蛋白表达与前列腺癌分化程度有相反的变化趋势;提示,检测STAT3蛋白的表达水平可协助判断前列腺癌分化程度并评估预后。

多囊肾小鼠肾功能的改变

目的探讨多囊肾脏组织特异性敲除小鼠(pkd1flox/-;Ksp-Cre mouse,简称PKD小鼠)肾功能在出生后随天数增加的变化情况。方法按SP级动物饲养标准进行饲养和繁殖PKD小鼠,选取出生后第1、3、6、91、2天五个时间点将PKD小鼠及野生小鼠(简写为WT组,下同)处死,分别检测其各时间点肾脏脏器系数,并应用尿素检测试剂盒对各时间点小鼠肾脏组织、血清中尿素含量进行检测。结果 PKD小鼠肾脏组织脏器系数在各时间点均明显高于野生组,P<0.05;PKD小鼠肾脏组织及血清中尿素含量在各时间点明显高于WT组,P<0.05;并随出生时间延长逐渐升高。结论本研究发现PKD小鼠出生后随着存活时间延长肾功能发生明显改变,并在生后两周内出现肾功能衰竭的相关症状。

前列腺癌组织中TGF-β1和wt-p53基因mRNA的表达及意义

目的探讨前列腺癌(PCa)组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、野生型p53(wt-p53)基因的表达及意义。方法应用RT-PCR技术检测正常前列腺、PCa组织和癌旁组织中TGF-β1、wt-p53mRNA的表达情况。结果正常前列腺外腺和癌旁组织间的TGF-β1、wt-p53表达水平相似(P>0.05);PCa组织中TGF-β1和wt-p53表达与正常PCa组织和癌旁组织相比差异显著(P<0.01);已有远处转移灶的PCa组织中TGF-β1和wt-p53表达与无转移者有统计学差异(P<0.01)。结论测定TGF-β1与wt-p53表达可协助PCa的诊断和评估预后。

林蛙卵油灌胃对于雄激素预处理大鼠妇科内分泌的影响

目的研究初生大鼠注射雄激素后,在成年期给予林蛙卵油灌胃,对于妇科内分泌激素水平的影响。方法乙醇萃取法提取林蛙卵精油,初生期给予雄激素制造动物模型,分为四组:高剂量组、中剂量组、低剂量组和模型组,同时设置正常对照。成年后给予治疗组林蛙卵油灌胃后处死大鼠,子宫和卵巢称重,血清放免法检测各组雌二醇、FSH、孕酮水平。结果模型组子宫及卵巢重量明显低于正常组(P<0.01),而林蛙卵油各剂量均可明显增加子宫及卵巢的重量(P<0.001),尤其以林蛙卵油高剂量组增加的最为明显。模型组卵巢体重之比明显低于正常组(P<0.05),而林蛙卵油各剂量均可明显增加卵巢体重之比(P<0.001),尤其以林蛙卵油高剂量组增加的最为明显。而林蛙卵油各剂量组对子宫体重之比没有明显影响。模型组大鼠血清中FSH、雌二醇、孕酮的含量与正常对照组相比明显降低(P<0.05),而林蛙卵油各剂量组均能明显提高大鼠体内FSH、雌二醇的含量,其中林蛙卵油中剂量对体内FSH含量增加最明显,而林蛙卵油大剂量对体内雌二醇含量增加最为明显,林蛙卵油各剂量组对体内孕酮含量的改变不明显。结论初生期雄激素注射通过影响卵巢发育对于成年内分泌系统造成影响,林蛙卵油可以发挥保护卵巢的作用,进而调节妇科内分泌功能。

NDRG3表达对前列腺癌细胞生长及抗药性的促进作用

目的:探讨NDRG3在人体前列腺细胞中的表达及外生性NDRG3对前列腺癌细胞的致癌潜能。方法:将NDRG3表达质粒稳定转染人类PC3前列腺癌细胞株,用一个NDRG3稳定表达亚克隆与做为对照的亲代和空质粒转染的PC3细胞,通过RT-PCR技术检测NDRG3基因在不同PC3人体前列腺细胞株中的表达情况。结果:NDRG3蛋白在2种前列腺癌细胞(PC3和DU145)和一种永生化前列腺间质细胞(WPMY-1)中都有表达,外源性的NDRG3能够显著地促进PC3细胞的增长率;NDRG3表达抑制美伐他汀引起的细胞凋亡。结论:NDRG3具有肿瘤促进功能并在前列腺癌的发生、发展中起一定作用。

林蛙卵油通过影响Bcl-2蛋白质家族抑制卵巢凋亡的机制

目的观察Wistar大鼠卵巢中Bcl-2和Bax的表达水平,分析林蛙卵油的卵巢保护作用机制。方法乙醇萃取法提取林蛙卵精油,初生期予雄激素制造动物模型,分为高剂量组、中剂量组、低剂量组和模型组四组,并设置正常对照组。成年后给予治疗组相应剂量林蛙卵油灌胃后处死大鼠,Tunnel检测凋亡比率,Western印迹法检测各组Bcl-2和Bax的蛋白质表达水平。结果 Tunnel染色显示模型组的凋亡指数较正常对照组升高,给予林蛙卵油灌胃后,凋亡指数降低。正常对照组与模型组之间有显著差异,中剂量组和大剂量组与模型组比较有显著差异,小剂量组与模型组比较无显著差异。Western印迹实验显示:Bcl-2在模型组的表达较正常对照组低,给予林蛙卵油后,低、中、高剂量组表达有升高趋势,与模型组比较差异显著;Bax在模型组的表达较正常对照组高,给予林蛙卵油后,低、中、高剂量组表达有降低趋势,与模型组比较差异显著。结论林蛙卵油可以通过影响Bcl-2蛋白质家族抑制卵巢细胞的凋亡,发挥保护卵巢的作用。

人宫颈癌HeLa细胞氧化损伤中溶酶体与线粒体损伤的时间顺序及其意义

目的:探讨溶酶体及线粒体死亡途径在氧化应激诱导HeLa细胞凋亡过程中的时间顺序及其意义,阐明溶酶体膜通透性在氧化应激诱导线粒体凋亡过程中的重要作用。方法:以对数生长期人宫颈癌HeLa细胞作为研究对象,利用维生素K3(VK3)复制氧化应激模型,实验分为对照组、VK3 1h、VK3 3h、VK3 6h和VK312h作用组。MTT法检测各组细胞生存率;2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色检测细胞内活性氧(ROS)水平,吖啶橙(AO)染色观察溶酶体膜通透性,罗丹明123染色检测线粒体膜电势(ΔΨm),Western blotting法检测凋亡相关蛋白caspase-3活化片段的表达。结果:与对照组比较,VK3 6和12h组HeLa细胞生存率降低(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,VK3 6和12h组HeLa细胞内caspase-3活化片段表达水平增加(P<0.05)。DCFH-DA染色,VK3作用1、3及6h,HeLa细胞内绿色荧光增强。AO染色,VK3 3h和6h组可见HeLa细胞的溶酶体内红色颗粒状荧光减弱,细胞浆绿色荧光增强。罗丹明123染色,VK36h组可见HeLa细胞浆内红色荧光强度明显降低(提示ΔΨm下降)。结论:氧化损伤能够诱导溶酶体及线粒体死亡途径,并且溶酶体的变化先于线粒体,提示溶酶体通透性在氧化应激诱导线粒体凋亡过程中具有重要作用。

人质膜型唾液酸酶在前列腺癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨人质膜型唾液酸酶(NEU3)在维生素K3(VK3)诱导的人雄激素非依赖型前列腺癌PC3细胞凋亡中的作用及可能机制。方法:以稳定转染人质膜型唾液酸酶基因(neu3)的前列腺癌细胞(PC3-neu3细胞)为靶细胞,通过MTT、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色观察VK3作用下NEU3与凋亡的关系;应用细胞内活性氧(ROS)测定,Western blotting检测p65、Bcl-XL蛋白表达,探讨NEU3影响细胞凋亡的机制。结果:(1)VK3浓度相同时,PC3-neu3细胞的生存率高于PC3细胞,凋亡率低于PC3细胞;PC3-neu3细胞内ROS产生的荧光强度弱于PC3细胞。(2)在VK3的作用下,p65的蛋白表达在两组细胞中具有相同的趋势,均随VK3浓度的增加,蛋白表达增强;Bcl-XL的蛋白表达趋势则相反,PC3细胞组,Bcl-XL的表达随VK3浓度的增加逐渐减弱,而PC3-neu3细胞组则增强,两组比较差异显著(P<0.01)。结论:NEU3对VK3诱导的细胞凋亡具有抵抗作用,这一作用是通过降低细胞内活性氧水平,上调Bcl-XL和p65的蛋白表达实现的。