DHEA抑制大鼠转移性Morris肝癌的实验研究

目的 :探讨去氢表雄酮 (DHEA)的体内抗癌作用及其机制。方法 :Buffalo大鼠 2 1只随机分为空白对照组 (n=5 ) ;肿瘤对照组 (把 Morris肝细胞瘤移植到大鼠的两肋皮下 ,建立 Morris肝细胞瘤移植的 Buffalo大鼠的体内模型 ) ,喂养基础饲料 (n=6 )、DHEA肿瘤组 (建立 Morris肝细胞瘤移植模型后 ,在喂养的基础饲料中添加 DHEA) (n=6 )和去氢表雄酮硫酸酯 (DHEA- s)肿瘤组 (建立 Morris肝细胞瘤移植模型后 ,在喂养的基础饲料中添加 DHEA - s) (n=4 )。分别喂养 4周后 ,应用流式细胞术检测大鼠的免疫功能 ,应用磁场型高分解能质量分析仪 (GC/ MS)方法测定大鼠体内类固醇的含量 ,采用免疫组化方法染色检测磷酸化的磷酸酶和张力蛋白同源物基因 (PTEN )蛋白表达 ,同时测定其对大鼠的毒副作用。结果 :DHEA肿瘤组的瘤重量 [(8.31± 0 .6 1) g]较肿瘤对照组 [(14 .5 7± 0 .5 6 ) g]显著减小 ,抑制率达到 4 3%。免疫组织化学染色显示 DHEA肿瘤组的磷酸化PTEN蛋白表达量增加 ,同时提高了 CD3、CD4阳性细胞百分率及 CD4 + / CD8+比值 ,与肿瘤对照组相比差异有显著性 (P<0 .0 5 )。 DHEA肿瘤组的胆固醇、甘油三脂及高密度脂蛋白的含量与空白对照组相比差异无显著性 ,未见其有毒副作用。结论 :DHEA对肿瘤具有明显的抑制作?

应用微囊化转基因细胞进行小鼠腹腔移植的实验研究

目的:探讨微囊化转基因细胞用于异体细胞移植治疗的可能性。方法:使用静电液滴技术制备海藻酸钠-壳聚糖微胶囊,包埋转入癌胚抗原部分基因的人成纤维样骨髓基质细胞,进行实验小鼠腹腔移植。结果:微囊化人源细胞移植到小鼠腹腔3个月内,细胞可以继续生长、增殖并提高小鼠的兔疫功能。结论:海藻酸钠-壳聚糖作为成囊材料具有良好的生物相容性、囊膜强度和免疫隔离作用;微囊化细胞移植有助于扩大异体移植的细胞来源,并为构建微囊化转基因细胞疫苗治疗恶性肿瘤的研究提供了可靠的依据。

氨基胍对内毒素休克大鼠肝损伤的保护作用研究

目的 探讨诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)抑制剂氨基胍对内毒素休克大鼠肝脏的组织学和超微结构的影响。方法 取雄性Wistar大鼠 2 4只 ,随机分为正常对照组、内毒素对照组和氨基胍治疗组 ,每组各 8只。用大肠杆菌内毒素 (LPS)复制大鼠内毒素性休克模型 ,氨基胍治疗组采用氨基胍治疗。观察并比较三组大鼠肝脏的组织学、超微结构及其血浆一氧化氮 (NO)含量的变化。结果 光镜下可见 ,内毒素组肝组织有散在小脓肿灶形成 ,肝细胞坏死 ,中性白细胞浸润 ,而氨基胍治疗组的肝组织受损程度较轻。电镜下可见 ,内毒素组的肝细胞核出现融解性空斑 ,线粒体肿胀和线粒体嵴数量减少 ,而氨基胍则对肝脏的结构起到一定的保护作用。内毒素对照组血浆NO水平明显高于正常对照组 ,给予氨基胍治疗后血浆NO水平明显下降 ,但仍高于正常对照组。结论 氨基胍通过选择性抑制iNOS活性 ,抑制了大鼠内毒素休克时过量的NO的产生 ,保护了肝脏的功能 ,具有潜在的临床应用价值 ,值得更深入地研究。

体外培养系统中IL-18诱导的快速肿瘤杀伤效应影响因素的研究

目的 :应用rhIL 18在体外培养系统 (Coculturesysteminvitro ,CCs)中诱导快速肿瘤杀伤效应 ,并对这种快速杀伤效应的影响因素进行了探讨。方法 :采用StemSepTM 免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及树突状细胞 (DCs) ,流式细胞仪分析细胞表型 ,1 2 5I UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性。结果 :rhIL 18在CCs中能够诱导快速肿瘤杀伤效应 ,这种杀伤效应与rhIL 18含量呈剂量依赖关系 ,DCs和T细胞的存在与否对这种杀伤效应无明显影响 ,同时这种快速杀伤效应无抗原特异性、不受MHC的限制。结论 :在体外培养系统中只要有rhIL 18和NK细胞的存在 ,即能产生对肿瘤细胞的快速杀伤效应 ,即这种快速杀伤效应细胞为NK细胞。

CEA迷你基因原核表达及其诱导小鼠特异性淋巴细胞增殖的研究

目的在原核细胞中表达人癌胚抗原（CEA）的迷你基因短肽，纯化及鉴定目的蛋白，并检测其在小鼠体内的抗原性。方法利用PCR技术从人基因组中得到一段来源于CEA的DNA序列，其中包含两个编码分别能被HLA—DR4／9、HLA—DR53以及HLA-DR4／7／9型别的人群所识别辅助性T细胞（HTL）表位的迷你基因，构建重组表达质粒pQE30-CEA625-667，在大肠杆菌M15中诱导表达。Westren Blot杂交鉴定、镍凝胶亲和层析法纯化目的蛋白。3H—TdR掺入法检测目的短肽诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应。结果CEA625-667短肽在大肠杆菌M15中以包涵体形式表达。Western—blot结果显示，在相对分子质量约6700处有表达产物与6×hismAb特异性结合带。镍柱纯化后可得到纯化的目的蛋白.3H-TdR掺入实验所得不同浓度的CEA625-667与小鼠脾细胞共孵育7～9d后的刺激指数相继达到对照组的10倍以上。结论成功诱导了CEA625-667短肽的原核表达，通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的CEA625-667短肽，并证明在一定浓度下目的短肽可于体外诱导小鼠的特异性淋巴细胞增殖。为CEA625-667迷你基因作为表位疫苗在抗肿瘤方面的进一步研究提供条件。

C-MYC基因在肝癌与肝硬化组织中扩增的实验研究

目的研究C-MYC基因在肝癌及肝硬化组织中的扩增情况.方法采用聚合酶链式反应(PCR)对32例肝癌及12例肝硬化组织中的C-MYC基因扩增情况进行研究,并通过激光密度扫描仪对琼脂糖凝胶EB染色底片进行积分光密度分析.结果正常组织无C-MYC扩增,C-MYC与N-MYC+L-MYC比值95%可信区间为0.1325～0.5632,肝硬化组织扩增阳性率为8.33%,肝癌组织扩增阳性率43.75%.结论肝癌组织C-MYC扩增率高于正常组织和肝硬化组织,且C-MYC扩增者大多有淋巴结转移,组织分化差.检测C-MYC基因扩增情况可对肿瘤发生、发展及预后进行判断,并指导临床基因治疗.

β_2-GPI与细胞凋亡的关系研究

目的:探讨β2-糖蛋白-Ⅰ(β2-GPI)与凋亡细胞的结合是否通过磷脂酰丝氨酸(PS)。方法:采用UV照射的方法,诱导K562细胞凋亡,应用碘化丙啶、梯状电泳和β2-GPI检测细胞凋亡。采用β2-GPI与Annexin V的竞争实验来检测β2-GPI是否通过PS与凋亡细胞结合。结果:随着UV照射时间延长,K562细胞的凋亡率增加,在照射300秒时,凋亡细胞达到51.01%(47.23%±4.41%),DNA出现明显的片段化。rGFP连接的β2-GPI,与凋亡细胞结合,β2-GPI可以有效地检测细胞凋亡,而且与Annexin V竞争同一结合位点,即PS。4℃时β2-GPI与晚期凋亡细胞的结合高于37℃,而且随着时间延长,与凋亡细胞的结合均降低。结论:通过β2-GPI与Annexin V的竞争抑制实验第一次为“β2-GPI通过PS与凋亡细胞结合”这一推断提供直接的实验证据,第一次证实β2-GPI既可以与早期凋亡细胞结合,也可以与晚期凋亡细胞结合,rGFP-hβ2-GPI可以作为新的检测细胞凋亡的试剂应用。

HIV-1env、gag与IFNα-2b基因融合蛋白的免疫学研究

目的将编码艾滋病病毒(HI V-1)外膜蛋白的env基因、核蛋白的gag基因与编码干扰素(IFNα-2b)基因分别插入pSFJ16与pSFJ38真核表达载体,观察表达产物诱导机体产生细胞免疫的变化规律。方法利用分子生物学技术构建重组质粒,经质脂体转染与野生型痘苗病毒在Cos-7细胞内同源重组,筛选、纯化获得重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα-2b和vJ16env/IFNα-2b。免疫小鼠后,检测小鼠外周血与脾淋巴细胞对ConA及Lps的反应性,用流式细胞仪测定小鼠脾细胞CD4+、CD8+,细胞计数。结果外周血与脾淋巴细胞对ConA及Lps的反应性,实验组与对照组比较有显著差异(P<0.05)。CD4+T淋巴细胞与对照组比较有显著差异(P<0.05)。CD8+T淋巴细胞与对照组比较无显著差异(P>0.05),但呈增高趋势。结论重组痘苗病毒能诱导小鼠产生较强的细胞免疫。重组痘苗病毒能在体外与HI V-1env和HI V-1gag阳性血清发生特异性反应,具有免疫原性和免疫反应性。

MAGE-1基因疫苗的构建及其免疫学活性的研究

目的制备MAGE-1基因疫苗,观察该疫苗诱导小鼠脾脏的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞CTL活性及产生特异性抗体的影响。方法应用基因重组技术,构建基因疫苗pcMAGE-1;转染HEK293细胞;RT-PCR及Western blot检测MAGE-1mRNA及蛋白的表达;pcMAGE-1免疫3次BALB/c小鼠,末次免疫后7日收集血清及脾细胞。流式细胞术检测血清中抗MA-GE-1多抗的产生,MTT法检测小鼠CTL杀伤活性。结果构建的pcMAGE-1转染HEK293细胞,RT-PCR表明在mRNA水平有MAGE-1的表达;Western blot显示表达产物46kD,与预期一致。基因疫苗免疫组小鼠血清MAGE-1抗体的产生增加,与SMMC-7721结合率显著高于对照组(P<0.05)。杀伤实验结果显示,免疫组小鼠脾细胞对SMMC-7721的杀伤率明显高于两个对照组(P<0.05)。结论成功地构建了MAGE-1基因疫苗,该疫苗能够有效地诱导特异性免疫应答。

重组分泌型人PSP94对前列腺癌细胞株PC-3抑制作用的研究

目的:探讨重组分泌型人PSP94(rsHPSP94)对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3生长的作用和作用机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)法检测rsHPSP94对PC-3的抑制率。流式细胞仪检测细胞周期分布的变化。结果:rsHPSP94以剂量和时间依赖性抑制PC-3的增殖,流式细胞仪分析表明细胞增殖阻滞在G_1期,并出现凋亡。结论:本实验结果表明rsHPSP94通过使细胞阻滞在G_1期抑制PC-3细胞的增殖。

流式细胞术检测细胞毒方法的建立

目的 :建立一种用流式细胞仪测定细胞介导细胞毒活性的方法。方法 :用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞 ,再用碘化丙碇 (PI)标记DNA筛选细胞膜已破坏的靶细胞。效靶比为 10 0∶1～ 6 2 5∶1,共孵育时间为 1～ 6小时 ,流式细胞仪收集 10 0 0个靶细胞并测定被杀细胞的百分率。结果 :CFSE是合适的标记靶细胞的荧光染料 ,18小时后也能很好地区分效靶细胞 ;靶细胞的自然死亡率低于 5 % ;杀伤百分率随着效靶比和共孵育时间的增加而增加。最佳效靶比为5 0∶1～ 2 5∶1,共孵育时间为 2～ 4小时。结论 :CFSE PI双荧光染料标记的流式细胞分析检测细胞毒具有多个优点 :避免放射性试剂的应用 ,敏感性增强 ,单细胞水平的分析。

IL-18在体外培养系统中诱导肿瘤快速杀伤效应及肿瘤特异性CTL

目的 应用rhIL 18在体外培养系统 (Coculturesysteminvitro ,CCs)中诱导快速肿瘤杀伤效应及诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CytotoxicTLymphocyte ,CTL)。方法 采用StemSepTM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及树突细胞 (DCs) ,流式细胞仪分析细胞表型 ,12 5I UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性 ,ELISA方法检测IFN γ的产生量。结果 在CCs中 ,rhIL 18诱导出快速肿瘤杀伤效应 ,这种杀伤效应无抗原特异性、不受MHC限制 ,DCs和T细胞的存在与否对其无明显影响。在同一培养系统中 ,肿瘤抗原存在的条件下 ,96h后 ,rhIL 18能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应。结论 rhIL 18能够在体外培养系统中相继诱导肿瘤快速杀伤效应及肿瘤特异性CTL。

氨基胍对内毒素休克大鼠肝脏功能的保护作用

目的 :探讨诱导型一氧化氮合酶 ( i NOS)抑制剂氨基胍 ( AG)对内毒素休克时肝损伤的治疗作用。方法 :雄性 Wistar大鼠 32只 ,随机分为正常对照组、内毒素对照组、去甲肾上腺素治疗组和氨基胍治疗组 ,每组各 8只。用大肠杆菌内毒素 ( LPS)复制大鼠内毒素性休克模型 ,分别给予去甲肾上腺素 ( NA)和 AG治疗 ,观察各组平均动脉压 ( MAP)、心率 ( HR)及肝脏功能的变化。结果 :AG( 2 0 mg.kg-1)能使血压在 5 0 min后恢复至基础水平 ,并且能够减轻内毒素血症导致的血浆 GOT和 GPT水平增高。结论

β_2-糖蛋白1与川崎病患儿血小板结合水平测定及意义

目的了解β2_糖蛋白1与川崎病患儿血小板结合水平,分析其在川崎病发病机制中的作用。方法应用流式细胞技术检测和分析29例川崎病患儿血小板与β2_糖蛋白1结合水平。结果29例川崎病患儿血小板与β2_糖蛋白1结合水平明显升高,与正常儿童比较差异有显著性(P<0.001);17例合并冠状动脉扩张,其血小板与β2_糖蛋白1结合水平与未合并冠状动脉扩张者比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论β2_糖蛋白1与血小板的大量结合可能是导致川崎病高凝状态、血管炎发生的重要机制之一,可作为冠状动脉病变的指标,为预防和及早治疗冠状动脉病变提供依据;血小板活化是川崎病发病机制中重要环节。

紫草萘醌组分抑制移植性肝癌新生血管的形成

目的研究紫草萘醌组分体内抗肝癌作用机制。方法建立可移植性小鼠Hep-A-22肝癌皮下接种动物模型,5-氟尿嘧啶(5-FU)腹腔注射,20 mg/kg;三组紫草萘醌组分制剂灌胃(2.5、5.0、10.0 mg/kg);阴性对照组予以相同容积的溶剂灌胃。以肿瘤称重为观察指标;采用免疫组织化学染色方法测定肿瘤微血管密度(MVD)和癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果三组紫草萘醌类化合物均明显抑制可移植性肝癌原位生长;抑制Hep-A-22肿瘤细胞的VEGF表达并降低肿瘤组织的MVD。结论紫草萘醌萘醌组分对小鼠肝癌移植瘤具有增殖抑制作用,对肿瘤VEGF生成的抑制可能为其机制之一。

WAF1基因检查在胃癌诊断中的意义

目的探讨 ＷＡＦ１基因与胃癌的关系。方法对 ４１例胃癌组织和 ２６例癌旁非病变粘膜分别作冰冻切片并提取组织总ＲＮＡ，应用细胞原位杂交技术及 ＲＴ－ＰＣＲ结合 ＳＳＣＰ方法，联合检测 ＷＡＦ１与 ｐ５３基因异常及表达情况。结果胃癌组织ＷＡＦ１基因缺失率和 ｍＲＮＡ不表达率分别为 ３４．４％和 ４０．６％，明显高于癌旁非病变粘膜（Ｐ＜．０５）；胃癌组织ｐ５３基因突变率和ｍＲＮＡ过表达率也明显高于癌旁非病变粘膜（Ｐ＜０．０５）。ＷＡＦ１基因缺失和ｍＲＮＡ不表达与胃癌的分化程度和浸润深度有关。结论胃癌的发生和发展与ｐ５３基因突变以及ＷＡＦ１ｍＲＮＡ不表达有关，胃癌组织中ｐ５３失活与ＷＡＦ１ｍＲＮＡ不表达关系密切。检测胃癌组织中ＷＡＦ１变化可为胃癌的诊断、病理分期、预后评估和基因治疗提供可靠依据。

门奇断流术和肠腔侧侧分流术治疗门脉高压症的探讨

目的:探讨门奇断流术和肠腔侧侧分流术治疗门脉高压症的疗效。方法;采用先进的实验方法,吲哚氰绿负荷实验对门脉高压症患者分别行门奇断流术和肠腔侧侧分流术,进行手术前、后肝血流量、KICG、FPP、胃壁压的测定。结果:门奇断流手术前、后肝血流量、KICG、FPP无明显变化,胃壁压手术后较手术前有所增高,平均增高8.7％;肠腔侧侧分流手术前、后肝血流量、KIOG均有不同程度的降低,平均降低17％。结论:门奇断流术对肝血流量和肝机能无明显影响;肠腔侧侧分流术对肝血流量和肝机能有一定影响,但影响并不很大。

血管内皮生长因子反义基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞的生长抑制作用

目的构建反义血管内皮生长因子(VEGF165)基因真核表达载体,分析该基因对乳腺癌细胞的生长抑制作用。方法将人VEGF165cDNA反向克隆至pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7,观察转染前后MCF-7细胞的VEGF165表达及细胞生长周期。结果所构建的VEGF165反义基因真核表达载体转染MCF-7细胞后,VEGF165表达下降,细胞生存率下降,G1期细胞数量增加,S期细胞数量减少,细胞增殖能力降低。结论成功构建了VEGF165反义基因表达载体,该基因对乳腺癌细胞的生长具有明显的抑制作用。

IL—4对小鼠腹腔巨噬细胞抗弓形虫作用的影响

目的：观察体外IL-4和IFN-γ对^3H—尿嘧啶(^3H—U)标记的弓形虫(Toxoplasma gondii,TG)在小鼠腹腔巨噬细胞(Mouse peritoneal macrophage MPM)内增殖的影响。方法：应用^3H—U标记的TG在MPM内的增殖实验及^125I—UdR标记的细胞毒实验。结果：单独应用IL-4预先处理MPM，可部分抑制TG在MPM内的增殖，增加IL-4剂量抑制作用末见明显增加；IL-4可增加IFN-γ诱导的MPM抗TG效应，但无协同作用。结论：表明IL-4对小鼠MPM抗TG作用与IFN—γ不同；抗TNF—α中和抗体对IL-4诱导的TG在细胞内增殖抑制作用无明显影响。

TRFIA测定HCV的假阳性和解决方法

目的了解时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测HCV的假阳性率,为临床检测HCV提供参考方法。方法 TRFIA法检测了3854份血清标本,筛选HCV结果为弱阳性的28份标本,用酶联免疫吸附试验(EL1SA)复核检测,复查ELISA为阳性的发阳性报告;ELISA法检测结果阴性者,用PCR法再次复查,阴性者发阴性报告。结果 TRFIA法检测HCV的假阳性率为0.441%(17/3854),而用PCR法再次复查后假阳性占总检测标本百分比降至0.415%(16/3854)。结论 TRFIA法检测HCV假阳性偶有发生,绝大多数可以通过用ELISA法复检加以纠正。