CD14和IL-8基因多态性与新生儿坏死性小肠结肠炎易感性的关联性分析

目的：探讨白细胞分化抗原14（CD14）-159C/T（rs2569190）和白细胞介素8（IL-8）-251A/T（rs4073）基因多态性与坏死性小肠结肠炎（NEC）易感性之间的关系,阐明NEC易感性的可能影响因素,为NEC的发病机制研究提供遗传学理论依据。方法：选取28例NEC新生儿（NEC组）和41例非NEC新生儿（对照组）作为研究对象,提取并应用基因聚合酶链式反应（PCR）扩增其外周血DNA,并采用Sanger基因测序方法,检测CD14-159C/T和IL-8-251A/T区域的等位基因频数和基因型频数的分布,探讨其与NEC易感性的关联性。结果：CD14-159C/T和IL-8-251A/T位点基因型频数分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P〉0.05）;CD14-159C/T的等位基因和基因型频数分布在2组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）;IL-8-251A/T位点的基因型频数分布在2组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）;而NEC组IL8-251A/T基因位点T等位基因频数分布高于对照组（χ~2=4.184,P=0.041,OR=2.14,95%CI：1.03~4.46）。结论：CD14-159C/T的基因位点多态性和NEC的发病无关联,而IL-8基因的-251T位点与NEC发病易感性存在关联,IL-8基因的-251T等位基因突变可能是NEC的危险因素之一。

实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价

目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法，为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区，依据双歧杆菌的16 SrRNA序列共设计3条引物，以常规 PCR扩增出的16 SrRNA部分基因片段制作标准品，应用 SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料，对连续稀释的标准品及待测样本进行分析，建立绝对定量的标准曲线，同时计算出待测样本双歧杆菌浓度；根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度；分析 PCR产物熔解曲线评价反应特异性；重复检测梯度稀释的标准品，用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp，测序结果正确，成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品；生成的标准曲线R2＝0.999，最低检测限度为每个反应1.48＆#215;102个拷贝；实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量 PCR检测，各组间每微升1.48×10^3～1.48×10^7个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94％、3.39％、3.54％、3.08％和3.34％。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数·-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量 PCR法敏感性高、特异性强，且重复性好，适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。