胡椒碱对人肝癌HepG2细胞抗肿瘤活性的体外实验研究

目的探讨胡椒碱(piperine)对人HpeG2肝癌细胞株的增殖、杀伤和细胞凋亡的影响,为肝癌的治疗提供理论依据。方法体外培养的HpeG2细胞,采用MTT比色法检测不同浓度胡椒碱对体外培养的HepG2细胞和新分离的外周血白细胞的增殖抑制作用。Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态,采用流式细胞术测定胡椒碱对HepG2细胞的凋亡。结果胡椒碱对HepG2细胞增殖的抑制率随着浓度的升高而增加,半量抑制浓度(IC50)为15.13±3.21μmol/L,低于其对外周血白细胞的抑制率(64.52±5.32μmol/L)。Hoechst 33258染色后,胡椒碱处理癌细胞组表现出典型的细胞凋亡特征,流式细胞仪检测20μmol/L的胡椒碱处理HepG2细胞24h后,细胞凋亡率由对照组的2.89%上升到了21.76%。结论胡椒碱具有抑制HepG2细胞增殖和诱导凋亡的抗肿瘤活性,有应用于肝癌治疗的潜在价值。

网络成瘾大学生的感觉寻求水平及神经诱发电位特征

目的:比较网络成瘾大学生的感觉寻求差异、神经诱发电位特征,为探讨网络成瘾机制提供基础。方法:采用Young氏网络成瘾诊断问卷、感觉寻求问卷作为研究工具,对1784名在校大学生进行问卷调查;选择网络成瘾与非成瘾志愿者各10名进行以90dB的短纯音作为刺激检测其长潜伏期听觉诱发电位。结果:网络成瘾大学生占总人群的7%,男性网络成瘾者显著多于女性(P<0.05),年级间网络成瘾检出率差异无显著性(P>0.05)网络成瘾大学生在感觉寻求的去抑制因子和总分上高于非成瘾者(P<0.05);网络成瘾者的N1波幅在Fz部位高于非成瘾者(P<0.05),网络成瘾与感觉寻求之间存在正相关关系(r=0.340,P<0.01)。结论:网络成瘾者与非成瘾者的感觉寻求水平与神经诱发电位有关联,高校应该关注高感觉寻求者的精神生活,避免网络成瘾。

CD200基因重组质粒延长异基因小鼠皮肤移植物存活的实验研究

目的:利用小鼠同种异体皮肤移植模型,观察重组基因CD200的抗排斥作用。方法:用肌肉注射并电转染的方法,将pcDNA3-CD200基因重组质粒100μg转染到受者BALB/c小鼠体内,同日进行皮肤移植,记录移植皮片的存活时间,采用RT-PCR和免疫荧光的方法检测CD200基因在受者体内的转录和表达,用HE染色观察移植皮片组织病理改变情况。用MTT法检测受鼠对供鼠及第三方供鼠的单向混合淋巴细胞反应(MLR)。结果:RT-PCR和免疫荧光检测表明,肌肉注射并电转染pcDNA3-CD200基因重组质粒后,可在肌肉组织中检测到CD200基因的转录和表达。空白对照组移植皮片平均存活时间为(8·67±1·75)天,pcDNA3空质粒组移植皮片平均存活时间为(8·00±1·55)天,pcDNA3-CD200组小鼠移植皮片平均存活时间为(11·78±1·86)天,移植皮片的存活时间显著延长(P<0·05);pcDNA3-CD200组移植皮片内浸润的炎细胞数量明显减少;MLR检测表明pcDNA3-CD200组的BALB/c小鼠对C57BL/6供鼠的MLR明显低于空白对照组(15天时0·11±0·02低于0·19±0·03,P<0·05),对第三供鼠的MLR也相似。结论:肌肉注射并电转染pcDNA3-CD200基因重组质粒可在小鼠体内大量转录和表达并延长了皮肤移植物的存活时间,减少移植物内炎细胞浸润,降低混合淋巴细胞反应,具有显著的抗排斥作用。

儿童肺炎支原体肺炎血清中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10浓度测定及其临床意义的研究

目的:检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia,MP)肺炎患儿血清中肿瘤坏死因子-a((Tumor necrosis fac-tor-a,TNF-a)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)和白细胞介素-10(Inter-leukin-10,IL-10)浓度的变化,探讨其与临床表现的相互关系。方法:应用ELISA双抗体夹心法对42例(实验组)肺炎支原体肺炎急性期患儿和34例(对照组)健康儿童血清中TNF-a、IL-6、IL-8和IL-10浓度进行检测。结果:肺炎支原体肺炎患儿血清中TNF-a、IL-6、IL-8和IL-10浓度明显高于对照组,统计学有显著性差异(P<0.01);而治疗后恢复期其浓度明显下降,但仍高于对照组,统计学无显著性差异(P>0.05);肺炎支原体肺炎有胸腔积液的患儿X线胸片检查出现肺部纤维化改变者,血清和胸水中TNF-a、IL-6、IL-8和IL-10浓度较肺部无纤维化改变者明显增高(P<0.01),胸片检查肺部无纤维化改变者,其血清与胸水中TNF-a、IL-8比较无显著性差异(P>0.05)。结论:TNF-a、IL-6、IL-8和IL-10在肺炎支原体肺炎的发生发展过程中起重要作用,与肺部有无纤维化形成关系十分密切,是肺炎支原体肺炎诊断的重要因素之一。检测肺炎支原体肺炎患儿血清中TNF-a、IL-6、IL-8和IL-10浓度的变化对临床诊断治疗和预后均有一定的临床实用价值。

智力低下儿童与染色体脆性部位相关性的研究

目的:探讨智力低下儿童与染色体脆性部位表达率的相关性。方法:采用低叶酸、低小牛血清、较高PH值和G显带技术方法,对20例智力低下儿童和20例正常儿童的外周血淋巴细胞染色体畸变和脆性部位表达率进行分析。结果:智力低下儿童染色体畸变率为15·3%,对照组为3·7%;脆性部位发生率为26·95%,对照组为5·6%,两组的染色体畸变率和脆性部位表达率有明显的差异(P<0·01)。结论:智力低下儿童与染色体畸变率和脆性部位表达率有一定的相关性。

人胸苷激酶基因cDNA克隆

目的 克隆人胸苷激酶基因cDNA。方法采用逆转录PCR方法扩增胸苷激酶cDNA ,用十二烷基氟波酯 (TPA)刺激人外周血细胞的mRNA为模板 ;扩增的PCR产物经TA克隆重组和内切酶鉴定 ,以及DNA序列分析确定克隆基因的序列。结果经逆转录PCR扩增出一个 70 0bp左右的DNA片段 ,TA克隆出现 1 6个阳性克隆 ,选择其中的一个克隆 (TKTA8)进行DNA序列分析 ,序列分析结果表明TKTA8克隆重组的序列是人胸苷激酶的cDNA序列。结论从外周血细胞中得到了hTK完整的开放读码框架。

p21基因转染人胃癌细胞对化疗药物敏感性的影响

目的:探讨p21基因转染人胃癌细胞系(BGC)对化疗药物的敏感性。方法:应用MTT摄入方法测定5-氟尿嘧啶、阿霉素、长春新碱、环磷酰胺、平阳霉素和替尼泊甙对p21基因转染人胃癌细胞增殖抑制作用,并进行72 h观察。结果:p21基因转染人胃癌细胞对5-氟尿嘧啶最敏感,72 h抑制率为77.9%;其次为阿霉素、长春新碱、环磷酰胺、平阳霉素和替尼泊甙,其抑制率分别为62.7%、61.1%、59.3%、58.2%及45.9%。其敏感性与对照组相比差异有显著性(P<0.05),随时间延长而逐渐增加。结论:用MTT法检测p21基因转染人胃癌细胞对化疗药物敏感性的实验,即可以针对性指导临床对肿瘤敏感性化疗药物的选用,又可避免盲目用药而产生对机体免疫细胞的毒性作用。p21基因可提高对5-氟尿嘧啶的敏感性。

氧化铝生物陶瓷骨细胞相容性研究

目的 :观察氧化铝生物陶瓷材料的细胞相容性。方法 :选用 Wistar乳鼠颅顶骨成骨细胞 ,采用体外细胞培养方法 ,将细胞接种于氧化铝生物陶瓷材料表面后 ,分别观察 1、7、1 4、2 1、2 8d时细胞在材料表面的附着、增殖情况 ,采用 SEM观察细胞在材料表面的形态变化 ,并且对 2 8d内细胞的碱性磷酸酶活性进行检测。结果 :成骨细胞在材料表面的细胞增殖数与对照组间差异无显著性 ,细胞在材料表面伸展良好 ,粘附牢固 ,并具有良好的细胞形态及增殖率 ,碱性磷酸酶活性逐渐增加。结论

藏灵菇发酵乳中降胆固醇乳酸菌的分离及鉴定

目的:筛选具有降胆固醇功能的乳酸菌菌株,为乳酸菌体外、体内的降胆固醇生理特性和机制研究奠定基础。方法:利用邻苯二甲醛法从源于藏灵菇发酵乳中的7株乳酸菌中筛选具有较高降胆固醇能力的乳酸菌菌株,并研究其耐酸性、耐胆盐活性、生长曲线、产酸特性及抑菌特性;结合生理生化实验及16SrRNA寡核苷酸碱基序列分析鉴定菌株。结果:筛选得到1株降胆固醇效果明显的乳酸菌LA1,胆固醇降解率达到50.36%,且呈现较好的耐酸性和耐胆盐活性,其中LA1在第10小时进入对数生长期,第18小时进入稳定期;其能在pH1.5的MRS培养基中存活至少3h,在含0.3%胆盐的MRS培养基中生长良好,经鉴定为嗜酸乳杆菌;抑菌实验表明:该菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用。结论:该菌株可作为后续体内活性和机制研究的原始菌株。

白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与其毒力的关系

目的:探讨临床白色念珠菌感染者不同标本中分离的白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与其毒力的关系。方法:分别采用牛奶平板和卵黄培养基法检测白色念珠菌感染者不同标本(痰、血液、鹅口疮、伤口、阴道分泌物)中分离的190株白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶的活力,分别将产酶株的菌丝相和孢子相菌悬液(5×106CFU.mL-1)注射小鼠尾静脉,1个月内观察小鼠死亡率及平均存活时间,以平均存活时间评价菌株毒力。结果:190株白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶阳性检出率分别为83.68%和85.26%。动物实验结果表明,菌丝相白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶的活力均显著高于孢子相(P<0.01,P<0.05);注射菌丝相白色念珠菌的小鼠死亡率高于注射孢子相的小鼠(P<0.05),且平均存活期短于注射孢子相的小鼠(P<0.01)。结论:分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶是白色念珠菌重要毒力因子,酶活力可直接地反映其毒力和致病性。

老年支气管哮喘患者血清中白细胞介素及肿瘤坏死因子的检测及意义

目的探讨白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-10(Interleukin 10,IL-10)和肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosis factor,TNF-α)水平在支气管哮喘患者发病机制中的作用。方法选择支气管哮喘急性发作期患者组26例和缓解期患者组22例,健康人(对照组)22例的血清。采用双抗体夹心ELISA法分别测定血清中IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α水平的变化。结果支气管哮喘急性发作期和缓解期患者血清中IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α水平明显升高,与对照组比较差异有显著性(P<0.01),但急性发作期和缓解期患者血清中IL-8相比较无显著性差异(P>0.05)。结论测定IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α的水平可作为判断哮喘疾病程度的重要参考指标,为探讨支气管哮喘发病机制奠定理论基础。

hTK1质量放大压电石英晶体免疫传感器研究

目的研制高灵敏度的质量放大压电石英晶体免疫传感器用于人血清中癌症标志物胸苷激酶1(hTK1) 的检测.方法将半胱氨自组装膜用戊二醛活化,共价固定hTK1抗原,通过和待测抗原竞争与一定浓度的酶标抗体反应,应用4-氯-1萘酚和H2O2质量放大体系,测得样品中待测抗原的浓度.结果 hTK1 的浓度在 0.1～10 ng/ml 范围内,与传感器频率的变化之间呈良好的线性关系.应用此方法对患有不同癌症病人血清进行测定,发现正常血清与癌症血清的频移值存在显着差异.结论基于质量放大原理的压电石英晶体免疫传感器可定量测定血清中的 ng 水平的 hTK1 抗原,有望用于癌症的早期诊断和临床检测.

原发性肝癌患者血清中TNF-a、IL-6、IL-8和sIL-2R的测定及其临床意义

目的探讨原发性肝癌(primary hepatic cancer,PHC)患者血清中肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)水平及其临床意义。方法采用ELISA法测定血清中TNF-a、IL-6、IL-8和sIL-2R的含量;观察患者治疗前后细胞因子变化及其预后的关系,并设正常对照组。结果PHC患者血清中TNF-a、IL-6、IL-8和sIL-2R含量明显高于对照组(P<0.01);临床Ⅲ期患者血清TNF-a和sIL-2R含量明显高于Ⅰ期(P<0.01);肿瘤根治术后血清中TNF-a、IL-6、IL-8和sIL-2R含量较术前明显降低(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.01)。随着肝脏损伤程度的加重,血清中的TNF-a、IL-6、IL-8和sIL-2R含量随之增加。PHC患者在治疗前血清中sIL-2R和TNF-α水平明显地高于对照组(P<0.01),经治疗后与对照组比较仍有显著性差异(P<0.05)。结论提示检测PHC患者血清中TNF-a、IL-6、IL-8和sIL-2R含量,对了解PHC患者体内免疫状态、临床诊断和预后判断有重要意义。

藏灵菇发酵乳中乳酸菌的分离纯化与鉴定

目的从藏灵菇发酵乳中分离益生乳酸菌,并研究其生理生化特性,为今后功能性乳制品的开发提供优良菌种。方法用乳酸菌分离培养基从藏灵菇发酵乳中分离乳酸菌;对分离的乳酸菌进行生理、生化鉴定和16S rRNA序列测定,并对其生长特性、耐酸及耐胆盐特性进行分析。结果从藏灵菇发酵乳中分离出两株乳酸菌LP1和LA1,初步鉴定两株乳酸菌分别为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌;并能抵抗pH 3.0的酸性环境和0.3%-0.5%的高胆盐环境。结论植物乳杆菌LP1和嗜酸乳杆菌LA1具有较好的耐酸性和胆盐耐受力,具备作为益生菌应用的潜能。

禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白的质谱分析

在A型流感病毒等许多包膜病毒的病毒颗粒中,除包含病毒基因组编码的结构蛋白外,还包含来源于宿主细胞的多种蛋白。然而,在鸡胚内增殖的病毒颗粒所包含的宿主蛋白的种类尚不清楚。本研究采用20%～60%(w/w)蔗糖密度梯度离心法分离纯化了繁殖于鸡胚的流感病毒,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结合质谱法对纯化的流感病毒颗粒进行了全面的蛋白质组学分析。结果表明,在病毒颗粒中,除包含9种病毒编码蛋白外,还发现了12种来源于鸡胚的蛋白,如膜联蛋白A2、肽酰脯氨酰顺反异构酶B、过氧化物酶1、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶肌组织异构酶等,以及2种细胞骨架蛋白(微管蛋白b-3和肌动蛋白)。

人胸苷激酶单克隆抗体的制备

目的制备人胸苷激酶单克隆抗体。方法用大肠杆菌表达和纯化的人胸苷激酶免疫Balb/C小鼠,免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,HAT选择培养和ELISA筛选阳性克隆,阳性克隆杂交瘤注入小鼠腹腔制备腹水,用ELISA和免疫组化鉴定胸苷激酶单克隆抗体。结果经细胞融合和筛选得到37个阳性单克隆杂交瘤,其中有二株杂交瘤可以稳定地产生人胸苷激酶的特异性抗体,制备的腹水中有高效价的抗体活性。结论用原核表达的人胸苷激酶免疫小鼠可以制备出人胸苷激酶特异性单克隆抗体。

双歧杆菌BB12对肠炎沙门氏菌诱导Caco-2细胞分泌IL-8的影响

目的:体外研究双歧杆菌对肠炎沙门氏菌诱导Caco-2细胞分泌IL-8的影响。方法:建立双歧杆菌、肠炎沙门氏菌和结肠癌上皮细胞系Caco-2细胞共培养,逆转录PCR和实时荧光定量PCR和EMSA等方法检测细胞内IL-8 mRNA和NF-κBp65,ELISA法检测培养上清中IL-8。结果:对照组的Caco-2细胞低表达IL-8 mRNA,细胞核中很难检测出NF-κ Bp65,培养上清中IL-8的质量浓度为126ng/L。经肠炎沙门氏菌刺激后,IL-8 mRNA和NF-κB p65以及培养上清中IL-8的质量浓度(536ng/L)明显高于对照组(分别为P<0.01,P<0.01和P<0.01)。双歧杆菌和肠炎沙门氏菌共培养的Caco-2细胞中,IL-8 mRNA和NF-κB p65以及培养上清中IL-8质量浓度(336ng/L)显著低于肠炎沙门氏菌组(分别为P<0.01,P<0.01和P<0.01)。结论:双歧杆菌能明显抑制肠炎沙门氏菌诱导Caco-2细胞IL-8的分泌,其调节方式是抑制NF-κB p65的活化。

人CD200基因克隆及pcDNA3-CD200表达质粒的构建

目的 :克隆人 CD2 0 0基因并构建 pc DNA3- CD2 0 0表达质粒。方法 :采用逆转录聚合酶链式反应(RT- PCR)法 ,从用 2 0 0 μg Con A刺激 6 2 h后的正常人外周血白细胞中扩增出 CD2 0 0基因 ,与 p MD18T载体连接后 ,做全自动 DNA测序 ,并用亚克隆的方法构建 pc DNA3- CD2 0 0表达质粒。结果 :从正常人外周血白细胞扩增的人 CD2 0 0基因与 Gen Bank中人 CD2 0 0序列 (NM 0 0 5 94 4 )完全相同。结论 :成功地克隆人 CD2 0 0基因并构建了 pc DNA3- CD2 0 0表达质粒。

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因对人胃癌细胞的作用

目的:探讨大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因对胃癌细胞MKN-45的抑制及杀伤作用,并证实旁观者效应。方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-ePNP,将重组载体转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(ePNP)的MKN-45细胞克隆。在MKN-45/ePNP细胞培养物中加入前体药物MePdR,观察MePdR对该细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果:随MePdR浓度的增大,MKN-45/ePNP细胞的生存率逐步下降,在MePdR浓度达到1 mg.L-1时MKN-45/ePNP细胞全部被杀灭,而未经转染的MKN-45细胞的生存率则不受影响,MePdR对MKN-45/ePNP有显著的抑制及杀灭作用;当MKN-45/ePNP细胞占总细胞的10%时,全部细胞被杀死。结论:ePNP/MePdR自杀基因系统对胃癌细胞有生长抑制及杀伤作用并具有旁观者效应。

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及其在MKN-45细胞中的表达

目的克隆大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)基因并构建真核表达载体pcDNA3.1-EPNP,将重组质粒转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆。方法根据Gen-bank中大肠杆菌PNP基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物定向插入pMD-18T克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pcDNA3.1,利用脂质体将重组质粒转染MKN-45细胞。结果PCR扩增出716bp大小的片段,测序结果与已报道的EPNP基因序列一致;亚克隆经酶切鉴定正确;RT-PCR证明经G418筛选得到的转基因MKN-45细胞克隆中存在大量EPNPmRNA,前体药MePdR对转染EPNP的MKN-45细胞有较强的细胞毒作用。结论成功构建了大肠杆菌PNP基因的真核表达载体,获得了稳定表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆,为PNP/MepdR自杀基因系统在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。