日本血吸虫m6A修饰的性别相关circRNA鉴定

目的研究日本血吸虫雌雄成虫环状RNA(circRNA)的N6⁃腺苷酸甲基化(m6A)修饰,并对circRNA可能调控的miRNA进行预测。方法取(100±2)条日本血吸虫尾蚴,经腹部皮肤感染小鼠20 min,28 d后麻醉小鼠,用肝门静脉灌洗法收集虫体,分离雌雄虫,提取雌雄虫总RNA,分别取0.5μg和1.0μg点样在尼龙膜上,转移至紫外交联仪中,依次与m6A抗体(1∶1000)和HRP标记的二抗(1∶5000)孵育,进行斑点杂交。取雌雄虫总RNA各1μg,应用RNA甲基化共沉淀试剂盒进行免疫沉淀分离,RNA建库试剂盒进行建库,生物分析仪质量检测后在高通量测序仪上采用150 bp双端模式进行测序。应用Cutadapt软件(v1.9.3)除去序列中的接头与低质量序列,获得高质量序列。使用Bowtie2软件将序列与血吸虫基因组(Sja_WBPS14)匹配,以Find_circ软件识别序列中的circRNA,MACS软件识别序列中的甲基化位点。利用Heatmap2软件对差异表达的circRNA进行聚类分析,对差异有统计学意义的m6A修饰的circRNA进行来源基因的基因本体论(GO)富集分析。利用DiffReps软件分析m6A修饰的circRNA在雌雄虫的差异情况。通过RNAhybrid软件预测与circRNA相互作用的miRNA,将miRNA反转录后进行qPCR分析,2-ΔCt法计算miRNA相对表达水平。结果斑点杂交结果显示,日本血吸虫总RNA存在m6A甲基化修饰,且随着RNA量的增多,m6A甲基化信号趋于增强。高通量测序结果显示,日本血吸虫高质量序列占比高于99.9%,RNA富集与文库构建效果良好。来源于重叠区的circRNA占49%,其次是外显子(占29%)和基因间(占12%),来源于内含子(占2%)和反义链(占8%)的circRNA较少。雄虫中高富集的circRNA来源的基因可能与细胞代谢进程、细胞成分组织生物发生和应激等相关,雌虫中高富集的circRNA来源的基因可能参与细胞分子结合等过程。雌虫高丰度的m6A修饰circRNA有57个,雄虫有81个,雄虫富集的m6A修饰的circRNA数量高于雌虫(P<0.05,差异倍数≥2)。雌雄虫中m6A修饰circRNA可潜在与多个miRNA相互作用,如Sja⁃Bantam、Sja⁃miR⁃307在雌虫中呈现高表达,Sja⁃miR⁃8⁃3p、Sja⁃miR⁃3504等在雄虫中呈现高表达。结论本研究获得了日本血吸虫雌雄成虫m6A修饰的circRNA表达谱,初步揭示了m6A修饰circRNA可能调控的miRNA。