组织干细胞的培养及定向分化实验

如何将医学教育与前沿科学知识和实验技能结合,使学生及时了解科学发展的动态,在传承经典的同时掌握前沿科学知识和实验技能成为当今医学教育的新课题。实验以经典的细胞培养为主线,结合科学发展前沿的干细胞生物学,采用原代培养—传代培养—定向分化—染色鉴定4个连续的实验,建立了一个具有系统性、连续性和完整性的综合实验。实验项目融入了科技创新的成果,注重科研成果转化教学的应用,体现了基础与前沿的结合、经典与现代的结合,对培养学生的科学思维能力和解决问题的能力,掌握前沿科学知识和实验技能具有重要意义。

角膜缘干细胞移植治疗角膜疾病的研究进展

角膜缘干细胞在维持正常角膜上皮完整性以及角膜损伤修复中有重要作用。角膜缘干细胞损伤所致的角膜缘干细胞缺失可导致严重的角膜病变。目前治疗角膜缘干细胞缺失的主要方法是细胞移植治疗。本文就角膜缘干细胞的体外培养、鉴定、移植方法以及新的细胞来源等问题进行综述。

转录因子诱导人脐带间充质干细胞转分化为视网膜色素上皮样细胞的研究

目的探讨采用关键转录因子将人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-M SCs)转分化为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)样细胞的方法。方法通过流式细胞技术鉴定h UC-MSCs的表面标记分子;通过诱导h UC-MSCs分化成为脂肪、骨和软骨细胞确定其多系分化能力;采用慢病毒包装系统获得分别含有11个转录因子Sox2、Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx、Mitf-A、Klf4和c-Myc的病毒,并通过感染h UC-MSCs来诱导h UC-MSCs向RPE样细胞分化。结果 h UC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达CD11b、CD34,CD45和HLA-DR等分子标记,在成脂、成骨、成软骨分化培养基中可分化为脂肪、骨和软骨细胞。视网膜及RPE发育相关的关键转录因子能够将h UC-MSCs直接转分化为RPE样的细胞,并表达ZO-1、RPE65、Bestrophin-1(Best-1)、CK8/18、Cralbp、Mertk、Tyrosinase(Tyr)、PEDF等RPE细胞的特征分子。结论视网膜及RPE发育相关的关键转录因子可直接将h UC-MSCs分化为RPE样细胞。

氧化应激诱导的大鼠Müller细胞微小RNA表达谱的初步研究

目的研究在氧化应激条件下视网膜Müller细胞的miRNA表达谱,为寻找氧化应激条件下Müller细胞的靶向分子提供线索。方法用2 mmol乙二醛处理大鼠Müller细胞48 h,然后收集细胞,抽提总RNA,本研究采用小RNA两端加接头序列,反转录,克隆,随机测序的方法构建大鼠Müller细胞系的小RNA文库,序列经Genebank Blastn和miRBase比对分析,M fold软件在线预测二级结构验证miRNA,经qRT-PCR鉴定miRNA,通过miRPath分析müller细胞表达的miRNA相关信号通路。结果本文库获得163个有效序列,31个克隆为已知miRNA序列,代表13种miRNA,它们与PI3K-AKT,M APK,细胞外基质的合成及相互作用等多条信号通路密切相关。发现1个新miRNA序列。结论氧化应激条件下表达的miRNA为更好地了解在生理和疾病条件下的Müller细胞功能提供有益的线索。

角膜内皮细胞体外培养的研究进展

角膜内皮是角膜的重要组成部分,由单层的角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)组成,在维持角膜正常的透明度方面发挥着重要的作用。CEC在出生后即丧失增殖能力,一旦受损或丢失会导致不可逆性角膜疾病。但是,大量的研究表明CEC可以在体外增殖,这为体外培养人CEC用于角膜疾病的治疗提供了可行性,但至今仍没有建立一套标准的CEC体外培养方法。本文将归纳总结近年来CEC体外培养方法。以利于今后优化CEC体外培养体系。

GMFB在氧化应激诱导的ARPE19细胞中的表达及意义

目的 探讨胶质细胞成熟因子beta（GMFB）在氧化应激诱导的ARPE19细胞中的表达及意义。方法 用0、0.25、0.5、1、2 mmol乙二醛处理ARPE19细胞24 h,其中对照组用0 mmol/L乙二醛处理,实验组以0.25~2 mmol/L乙二醛处理,用Western印迹法检测GMFB的表达;实验组用1μg/ml GMFB处理ARPE19细胞24 h,对照组不做处理,进行RNAseq,比较实验组和对照组基因表达的差异,选取其中表达差异大于1.5倍且P〈0.05的基因作为差异表达的基因,对其进行GO及KEGG富集分析。结果 经乙二醛处理的各组ARPE19细胞GMFB表达上调,以0.5 mmol/L处理组的GMFB上调最为显著。对GMFB处理的ARPE19细胞进行全基因表达谱检测,结果显示,在被检测的19 966个基因中,实验组和正常组间有显著差异表达（改变1.5倍）的基因有583个。与对照组相比,实验组基因表达显著上调的有265个,下调的有318个。GO分析表明,GMFB与细胞代谢、细胞催化等生物过程相关。KEGG分析显示,GMFB与细胞代谢通路、癌症通路、Wnt信号通路、趋化因子信号通路等多条信号通路密切相关。炎症基因CCL26、CXCL8和NF-κB1表达升高,提示GMFB与炎症相关。结论 GMFB在氧化应激诱导的ARPE19细胞中表达明显上调,GMFB可能影响细胞间连接,参与Wnt信号通路、肿瘤相关信号通路和趋化因子信号通路等。

miR-124对Müller细胞转分化机制的影响

目的探讨过表达miR-124对Müller细胞转分化机制的影响。方法构建p Super-EGFP-miR-124质粒并测序验证,获得miR-124的过表达载体。并用其转染Müller细胞系,用G418进行筛选,获得Müller细胞稳转株,将样本送基因芯片检测。利用Target Scan和miRBase Targets数据库预测差异表达明显的miR-124靶基因,通过Real-Time PCR和荧光素酶活性测定实验验证分析miR-124的靶基因,筛选变化比较显著的基因进一步研究。miR-124转染Müller细胞,提取mRNA和蛋白,采用Real-Time PCR、Western印迹法检测相关基因的变化。结果成功构建p Super-EGFP-miR-124质粒并获得了稳定转染的Müller细胞系。荧光素酶报告分析表明,miR-124与STAT3 3'UTR相互作用。体外结果显示,p Super-miR124转染Müller细胞后,STAT3表达下降并开始表达光感受器细胞标志物CRX和RCVRN。结论 miR-124可能通过下调STAT3,上调CRX和RECVN,诱导Müller细胞向感光细胞转分化。

国际干细胞研究学会《干细胞临床转化指南》

《干细胞临床转化指南》（以下简称《指南》），概括并讨论了将干细胞的基础研究恰当而负责任地应用在临床上治疗患者时所需要考虑的科学标准、临床准则、管理规则、伦理以及社会问题。《指南》根据科学、临床和伦理的普遍准则，为干细胞转化研究参与者、临床科学家及有关的国际机构的管理人员提出了干细胞临床转化研究应遵守的建议。

线粒体DNA与DNA甲基化

线粒体是除细胞核之外唯一携带遗传物质的细胞器,其线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制着线粒体一些最基本的性质,对细胞功能有着重要影响。DNA甲基化是调节基因表达的重要方式之一。研究表明mtDNA存在CpG位点的低甲基化,并且mtDNA基因的表达受核DNA(nuclear DNA,nDNA)及线粒体自身DNA甲基化的调控,mtDNA和nDNA协同作用参与机体代谢调节和疾病发生发展过程。就近年来mtDNA与DNA甲基化的关系作一综述。

转化生长因子-β1对小鼠肝纤维化的促进作用

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对实验性小鼠肝脏细胞发生上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的促进作用,进而加速肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的形成。方法建立小鼠CCl4诱导HF模型,随机分为正常对照组、HF组与TGF-β1处理组。取对数生长期肝细胞,0.25%胰蛋白酶液消化细胞,0.4%FBS/DMEM同步化处理24 h后,按TGF-β1 2.5、5、7.5 ng/ml作用24、96、144 h分组给予相应处理,相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞组织化学及免疫荧光方法对细胞表型进行鉴定。RT-PCR及Western blot检测EMT[成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast specific protein-1,FSP-1),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),E-钙黏附素(E-cadherin,E-cad)]mRNA及蛋白表达情况。结果将含有TGF-β1无血清培养基刺激原代小鼠肝细胞48 h后可见较多肝细胞死亡,细胞数量减少,形态由多边形向梭形转变,96 h后小鼠肝细胞内出现凋亡小体,活细胞数量较少且大多数呈现间质细胞梭形形态。5 ng/ml的TGF-β1作用肝细胞96 h后,小鼠肝上皮细胞标志(E-cad)mRNA及蛋白表达逐渐减低,肝间质细胞标志(FSP-1和α-SMA)mRNA及蛋白表达逐渐升高(P<0.05)。结论 5 ng/ml的TGF-β1作用于HF的小鼠肝细胞96 h后,肝细胞发生EMT现象,TGF-β1有促进实验小鼠肝细胞的迁移、侵袭能力及细胞凋亡的作用,进而发生EMT导致HF。

Wnt信号通路参与实验性小鼠肝纤维化的研究

目的探讨Wnt信号通路对实验性小鼠肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的促进作用。方法建立小鼠CCl4诱导HF模型,随机分为正常对照组、HF模型组与Wnt处理组。体内实验对小鼠腹腔注射Wnt3A与Wnt11各5 ng/ml,每周2次,4周后获得肝组织;体外实验Wnt处理组为正常小鼠肝细胞在含有Wnt 5 ng/ml无血清培养基培养2周后,RT-PCR法检测肝细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙黏附素(E-cadherin,E-cad)、Wnt3A,Wnt5A与Wnt11。免疫荧光显微镜及激光共聚焦定位法分析肝细胞形态学变化。对培养细胞进行诱导分化,Massion染色法观察。结果体内试验HF小鼠肝细胞Wnt3A与Wnt11的免疫荧光分析及Massion染色显示,经Wnt3A与Wnt11处理后的小鼠肝上皮细胞标志(E-cad)减低,肝间质细胞标志(α-SMA)升高(P<0.05),发生了上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)。体外试验HF小鼠肝细胞RT-PCR分析表明:HF组与Wnt处理组与正常对照组比较α-SMA、Wnt3A、Wnt5A、Wnt11表达明显增加,E-cad表达明显减少(P<0.05)。病理学支持Wnt处理组显示了类似HF的小鼠肝细胞发生EMT的形态学改变。结论研究表明Wnt信号通路参与了小鼠HF的过程,其机制可能是在实验性小鼠肝上皮细胞中通过下调内源的某些自分泌信号抑制因子,而诱导细胞启动EMT程序,从而导致HF。

分泌型卷曲相关蛋白抑制实验性小鼠肝纤维化的研究

目的探讨分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled related protein,SFRP)对实验性小鼠肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)的抑制作用。方法建立小鼠CCl4诱导HF模型,随机分为正常对照组、HF模型组与SFRP2 shRNA处理组。小鼠肝细胞中获得总RNA,经RT-PCR转化cDNA,构建pcDNA1.0/SFRP2载体HF肝细胞并克隆获得pSilencerU6neo/SFRP2 shRNA稳定转染肝细胞。采用Westernblot、免疫荧光显微镜及激光共聚焦定位分析观察SFRP2 shRNA抑制HF作用。结果免疫双荧光显示SFRP2shRNA抑制HF小鼠肝细胞FSP-1 mRNA、Smad2 mRNA、Wnt3A mRNA的表达;经RT-PCR及Westernblot分析支持SFRP2 shRNA抑制HF小鼠肝细胞上皮-间质转换(Epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的发生(P<0.05);流式细胞仪分析表明SFRP2shRNA有缓解HF小鼠肝细胞凋亡的作用。结论我们研究证实SFRP在实验性小鼠肝上皮细胞中可能通过下调内源的某些自分泌信号抑制因子,抑制EMT程序,从而缓解HF。

体外神经视网膜重构及退行性眼病的临床治疗展望

细胞治疗是退行性眼病患者眼功能恢复的重要手段。目前,应用于临床退行性眼病细胞治疗的供体细胞有多种来源,其中常规来源的成熟供体细胞受困于多种制约因素,应用局限性很大。干细胞因为其多潜能性正成为新来源。近年来,利用干细胞分化重组眼组织取得重大突破,可以很容易地在体外重组获得具有类似新生儿眼组织的三维视网膜组织,克服了眼病细胞替代疗法治疗的瓶颈。本文将对细胞替代疗法治疗退行性眼病进行简要综述,并介绍干细胞体外重构视杯组织技术的临床应用前景。

胚胎干细胞相关的MicroRNA研究进展

MicroRNA是一系列高度保守的长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。这类小分子通过促进mRNA降解或抑制蛋白翻译来调节目的基因的表达。研究表明,MicroRNA在胚胎干细胞中起着重要的调节作用。本文主要阐述MicroRNA在胚胎干细胞干性维持和分化中的调控作用及其机制,就胚胎干细胞相关的MicroRNA研究新进展予以综述和讨论。

SCN5A-△KPQ变异的长QT综合征的细胞电生理

目的探讨长QT综合征3型(LQT3)的致病基因SCN5A及其相关的变异产生室性心律失常的细胞电生理机制。方法从野生型小鼠和SCN5A+/△的小鼠心脏中分离心室肌细胞,采用电流嵌和全细胞膜片钳技术分析了携带SCN5A△KPQ变异的小鼠心肌细胞的电生理学表型。结果与野生型细胞[(55.0±6.6)ms,n=7]相比,SCN5A+/△心肌细胞[(152±17.8)ms,n=6]动作电位明显延长(P<0.01);在SCN5A+/△心肌细胞中观察到早期后除极,而野生型心肌细胞中则未出现;全细胞记录表明SCN5A+/△心肌细胞有晚期持续钠电流,而在野生型细胞中未见。结论晚期持续钠电流可能是与SCN5A△KPQ突变相关的室性心律失常的主要机制。

哺乳动物早期胚胎发育的遗传程序

薛志刚，同济大学再生医学系干细胞研究中心研究员。2006年6日毕业于中南大学医学遗传学国家重点实验室，获博士学位，主要从事肿瘤的基因治疗。2006年7月～2007年11月，任中南大学医学细胞遗传学国家重点实验室讲师，主要负责基因治疗和干细胞相关的研究工作。2007年11月～2009年4日在美国加州大学洛杉矶分校人类遗传学系从事博士后研究，

辅助生殖中光照影响早期胚胎发育的研究进展

随着育龄人群不孕不育率逐渐升高（约12．5％-15％），辅助生殖技术（ART）已成为解决该问题的首选临床手段，同时也面临诸多问题如胚胎着床率及活体出生率偏低（分别为50％和35％左右）、先天缺陷率偏高（0．5％-1％）、糖代谢异常、DNA甲基化模式改变和印迹基因（如H19）的表达改变等。胚胎对体外培养环境要求非常严格，O2浓度、氨基酸成分、矿物油覆盖、培养体积、培养密度、温度、湿度、pH值、人工显微操作压力等均有可能造成胚胎发育异常，其中光照也是重要影响因素之一。