散发先天性心脏病致病基因SOX7新突变的发现及功能研究

目的:寻找散发先天性心脏病(CHD)致病基因SOX7新突变并研究其功能。方法:选取116例散发CHD患儿和228名无CHD对照儿童,对其SOX7基因进行测序分析,以发现新的致CHD突变。克隆SOX7基因并构建野生型人SOX7表达质粒,通过定点诱变产生突变型人SOX7表达质粒,使用脂质体转染多种表达质粒入HeLa细胞,应用双报告基因定量分析突变的功能效应。结果:在1例男性散发先天性室间隔缺损患儿中发现了SOX7基因新突变,即NM_031439.4:c.361C>T;p.(Gln121*)突变;在其他115例CHD患儿和228名无CHD对照者中未检测出该突变。双报告基因定量研究表明,突变型人SOX7对其关键靶基因GATA4的转录激活作用消失。结论:SOX7基因突变可能是一部分散发CHD的病因,这对CHD的个体化防治有潜在的临床意义。

先天性房间隔缺损致病基因KLF13新突变的识别与功能分析

目的:探索房间隔缺损致病基因KLF13新突变。方法:对175例先天性房间隔缺损患儿和217名健康者的KLF13基因进行测序分析以发现新的致病突变。克隆KLF13基因,构建野生型KLF13表达质粒KLF13-pcDNA3.1,通过定位诱变获得突变型KLF13-pcDNA3.1,转染NIH3T3细胞,通过报告基因分析研究突变体的功能特性。结果:在1例散发性先天性房间隔缺损患儿发现KLF13基因新突变,即NM_015995.4:c.85G>T;p.(Glu29*)突变。该突变不存在于217名健康者。生化分析表明突变型KLF13对靶基因ACTC1的转录激活功能丧失。结论:发现KLF13基因功能丧失性新突变可导致先天性房间隔缺损,这对先天性房间隔缺损的个体化医学防治有潜在的临床意义。

先天性动脉导管未闭致病基因MESP2新突变的发现与功能分析

目的:研究先天性动脉导管未闭(PDA)致病基因MESP2新突变。方法:选取2016年2月至2019年11月同济大学医学院附属同济医院儿科208例先天性心脏病(CHD)患儿和232名无CHD儿童,收集其血液标本及临床数据。常规纯化基因组DNA,测序分析转录因子基因MESP2以发现新的致病突变。克隆野生型MESP2基因并构建其真核表达质粒,通过定位诱变产生突变型MESP2表达质粒,转染HEK 293T细胞,通过报告基因分析揭示突变体的功能特性。结果:1例散发性先天性动脉导管未闭(PDA)患者检测出1个MESP2基因新突变,即NM_001039958.2:c.268G>T(p.Glu90*)突变。该突变不存在于对照组和其他CHD儿童中。报告基因分析显示突变型MESP2对靶基因NKX2.5的转录激活功能丧失。结论:MESP2基因缺陷可能是部分先天性PDA的分子病因,为先天性PDA的防治提供了新的分子靶标。

先天性室间隔缺损致病基因SOX18新突变的发现及功能研究

目的:探讨先天性室间隔缺损致病基因SOX18的新突变。方法:收集156例先天性心脏病患儿和216名无先天性心脏病对照者的临床数据和血液样本,提取基因组DNA,测序分析SOX18基因以识别新的致病突变。克隆SOX18基因,构建野生型SOX18表达载体,通过定点诱变产生突变型SOX18表达载体,转染HeLa细胞,应用双报告基因定量分析突变体的功能。结果:在1例散发性先天性室间隔缺损患儿中发现SOX18基因新突变,即NM_018419.3:c.430C>T;p.(Gln144*)突变。该突变不存在于其他先天性心脏病和对照者患儿。双报告基因定量分析表明突变型SOX18对靶基因NR2F2的转录激活作用丧失。结论:SOX18基因功能缺失性突变可能是部分先天性室间隔缺损的分子病因,这对先天性室间隔缺损的的精准防治具有潜在的临床意义。

单采血小板输注在儿童白血病和恶性淋巴瘤中的应用

为探讨儿童白血病和恶性淋巴瘤血小板显著减少期输注单采血小板的疗效，对１００例急性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤患儿输注单采血小板１单位后１８ｈ～２４ｈ测定外周血血小板计数，计算纠正计数指数（ＣＣＩ）和回升率及观察临床疗效。结果：９９例临床出血症状改善，１例因白血病复发全身衰竭、出血死亡，输注后血小板平均升高５３．４１×１０＾９／Ｌ。（Ｐ〈０．０１）；平均回升率３４．９％。血小板输注无效３０例（３０．０％）。结果表明，儿童白血病和恶性肿瘤血小板减少期输注单采血小板后临床止血效果好，副反应小。

长期传代后HL-60细胞内脱氧胞苷激酶与阿糖胞苷耐药性的关系

目的通过观察人早幼粒白血病细胞系(HL-60)及其耐药细胞株(HL-60/R)经过长期传代后细胞内脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,dck)mRNA表达及其酶活性的变化规律,探讨dck与阿糖胞苷(Ara-C)疗效及耐药现象发生的相关性。方法分别采用实时PCR方法和核素液闪法测定HL-60和HL-60/R细胞内dck的mRNA表达水平及其酶活性水平。通过体外培养传代,观察2种细胞株经长期传代(5、10、20、30、40、50代)后细胞内dck的mRNA表达及酶活性的变化规律。结果传代初期结果显示,HL-60和HL-60/R两组细胞株之间的mRNA表达水平分别为0.37±0.03和0.17±0.03,活性值分别为0.069±0.006nmol.min-1.mg-1 protein和0.019±0.007nmol.min-1.mg-1 protein,HL-60的dck mRNA表达水平和酶活性均明显高于HL-60/R(P<0.01)。并且两组细胞株之间的显著性差异(P<0.01)持续存在于各传代过程中。HL-60和HL-60/R两组各传代节点(10、20、30、40和50代)的dck mRNA表达水平与酶活性与本组第5代细胞相比,则无明显变化(P>0.05)。结论 HL-60及HL-60/R两组细胞株间的dck mRNA表达和酶活性在传代初期存在显著差异,且两组间的差异持续存在。但与各自的初期传代相比,长期传代后的dck mRNA表达和酶活性变化并不明显,提示dck仅与Ara-C的初期疗效明显相关,而与Ara-C耐药现象的发生可能无关。

先天性心脏病相关PITX2c基因新突变研究

目的:研究先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)相关PITX2c基因的新突变。方法:收集150例CHD患者和200名正常对照者的外周静脉血标本,使用DNA纯化试剂盒分离基因组DNA。使用DNA聚合酶扩增PITX2c基因的编码区和剪接位点,应用DNA测序试剂盒在DNA分析仪上对扩增片段进行测序。将所测序列与GenBank数据库中的PITX2c基因序列进行比对以发现PITX2c基因突变。使用在线程序MUSCLE分析突变氨基酸的保守性,分别应用MutationTaster和PolyPhen-2分析突变氨基酸的致病性。结果:在1例散发性CHD患者发现了1个新的PITX2c基因杂合错义突变,即p.S101G突变,突变率约为0.67%。该错义突变不存在于200名正常对照者。跨物种PITX2c蛋白之氨基酸序列对比显示第101位的丝氨酸在进化上完全保守,致病性预测显示所发现的PITX2c基因变异是致病性突变。结论:本研究揭示了CHD相关PITX2c基因新突变,对于制定新的CHD防治策略具有潜在的意义。

先天性心脏病患者GATA4基因突变谱分析

目的:分析先天性心脏病患者GATA4基因的突变谱,揭示先天性心脏病的分子病因。方法:收集110例无血缘关系的先天性心脏病患者的临床资料和血标本,以100名无血缘关系的健康者为对照。应用聚合酶链反应扩增先天性心脏病相关基因GATA4的全部编码外显子和外显子两侧的部分内含子,采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序。将所测的序列与GenBank数据库中的GATA4基因序列进行比对,识别出GATA4基因突变,并用序列比对在线软件ClustalW2分析突变氨基酸的保守性。结果:在3例无血缘关系的先天性心脏病患者的GATA4基因各识别出1个新的杂合错义突变,即P42T、V48M和S191I突变,这些突变不存在于正常对照者,而且突变氨基酸在哺乳动物进化上有高度的保守性。结论:该研究结果可能揭示了先天性心脏病新的分子病因,有助于先天性心脏病患者的早期防治。

先天性心脏病相关HAND1基因新突变研究

目的:研究先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)相关HAND1基因新突变。方法:入选CHD患儿136例及健康对照儿童200名,抽提基因组DNA,通过聚合酶链反应测序筛查HAND1基因突变。应用计算机软件评估突变氨基酸的保守性并预测突变的致病性,应用双荧光素酶报告基因分析系统分析突变对HAND1功能的影响。结果:在1例法洛四联征患儿发现1种新的HAND1基因杂合突变,其编码核苷酸序列第389位的胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤(c.389T>G),相应氨基酸序列的第130位亮氨酸变为精氨酸(p.L130R)。该突变改变了进化上保守的氨基酸序列并被预测为有致病性,功能研究揭示突变型HAND1的转录激活功能显著降低。结论:该HAND1基因功能缺失性新突变可能是CHD的少见分子病因。

缺氧诱导因子1-α基因C1744T多态与先天性心脏病的相关性研究

目的:研究缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF1α)基因C1744T多态与先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)的关系。方法:入选CHD患儿110例(病例组)及无CHD儿童200名(对照组),收集其临床资料和血标本,使用基因组DNA纯化试剂盒抽提基因组DNA。通过聚合酶链反应扩增HIF1α基因的第12个外显子,应用DNA测序试剂盒在DNA测序仪上对扩增片段进行测序。统计分析HIF1α基因C1744T多态在病例组和对照组间的频率分布。结果:HIF1α基因编码核苷酸序列第1744位的等位基因C、T及其构成的3种基因型CC、CT、TT在CHD在病例组和对照组间的频率分布存在显著性差异,病例组等位基因T及基因型CT和TT的频率较低(等位基因频率经Fisher精确检验比较,P=0.0179;基因型频率经Fisher精确检验比较,P=0.0139)。结论:HIF1α基因C1744T多态与CHD的易感性有关,等位基因T降低CHD的发生率。

先天性房间隔缺损相关TBX5基因新突变研究

目的:研究先天性房间隔缺损(ASD)相关TBX5基因新突变。方法:从中国汉族人群入选62例ASD患者和108名健康对照者,提取基因组DNA。对全部研究对象的TBX5基因的整个编码区进行测序分析以发现新的致病突变。构建野生型及突变型TBX5的真核表达载体,利用脂质体转染COS-7细胞,同时转染报告质粒心房利钠因子-荧光素酶及内对照质粒,应用双荧光素酶报告基因分析试剂研究突变型TBX5的转录活性。结果:在1例散发型ASD患者中发现了1个杂合性TBX5基因新突变,即c.318C>G(p.Y106X)突变。该无义突变不存在于108名健康对照者。功能分析表明突变型TBX5对靶基因的转录激活功能丧失。结论:发现1个ASD相关TBX5基因功能缺失性新突变,对ASD的个体化防治具有潜在的临床意义。

散发性先天性心脏病相关SMAD1基因新突变研究

目的:研究散发性先天性心脏病相关SMAD1基因新突变。方法:入选202例散发性先天性心脏病患儿和238名健康者,收集其临床资料和血标本并常规抽提基因组DNA,测序分析SMAD1基因以发现致病新突变。克隆SMAD1基因,构建野生型SMAD1表达载体SMAD1-pcDNA3.1,通过定点诱变产生突变型SMAD1-pcDNA3.1,转染COS7细胞,应用双荧光报告基因分析试剂研究突变的功能特性。结果:在1例散发性先天性右心室双流出道合并室间隔缺损患儿中发现SMAD1基因新突变,即NM_005900.3:c.381T>A;p.(Cys127^(*))突变。该突变不存在于238名健康者中。报告基因分析表明突变型SMAD1对靶基因TBX20的转录激活作用丧失。结论:SMAD1基因功能丧失性突变可能是部分散发性先天性右心室双流出道合并室间隔缺损的分子病因,这对先天性心脏病的精准医学防治具有潜在意义。

儿科临床实践教学示范病区建设的实施与成效

同济大学附属同济医院儿科教研室通过完成医学院《实践教学示范病区建设》项目，在完善项目建设计划、重视落实项目任务、提高教研室教学质量水平和人才队伍培养．以及将项目建设作为教研室教学质量的可持续提高条件等方面，均获得较为显著的成果。

先天性房间隔缺损相关GATA6基因新突变的检测与临床意义

目的识别先天性房间隔缺损（ASD）相关GATA6基因新突变。方法本研究为病例对照研究。选取2008年1月至2011年10月同济大学附属同济医院220例无血缘关系的汉族先天性ASD患者以及200名种族匹配的健康对照者。抽取外周血标本，应用聚合酶链反应扩增GATA6基因的全部编码外显子及其侧翼序列，采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序。借助BLAST程序将所测序列与GenBank中的已知序列进行比对以识别基因突变，并用ClustalW软件分析突变氨基酸的保守性。结果在3例ASD患者的GATA6基因各识别出1个新的杂合错义突变，即c．250G〉A（P．A84T）、c．649G〉C（P．G217R）和c．1270A〉C（P．S424R）突变。这3种突变均不存在于200名健康对照者中，多物种GATA6序列比对显示突变氨基酸在进化上相对保守。结论发现先天性ASD相关GATA6基因新突变，有助于揭示ASD的发病机制。

法洛四联症相关GATA6基因新突变的识别

目的识别法洛四联症（TOF）相关GATA6基因新突变。方法收集2007年1月至2011年10月在上海同济医院连续就诊的120例汉族TOF患者（男63例，女57例，年龄0．5～8．0岁）和200名种族匹配的健康对照者的临床资料和血标本，应用PCR扩增GATA6基因的全部编码外显子及其两侧的部分内含子，采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序。借助BLAST程序将所测序列与GenBank中的已知序列进行比对以识别基因突变，利用ClustalW软件分析突变氨基酸的保守性并用MutationTaster软件预测突变的致病性。结果在其中3例TOF患者的GATA6基因各识别出1个新的杂合错义突变，即第73、364和591位的密码子分别由CCC、AGC和GCC变为CTC、CGC和GGC，导致第73、364和591位的氨基酸分别由脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸变为亮氨酸、精氨酸和甘氨酸，亦即P．P73L、P．S364R和P．A591G突变。这3种突变均不存在于200名正常对照者中，多物种GATA6序列比对显示突变氨基酸在进化上高度保守，致病性预测显示这3种变异均为致病性突变。结论识别出TOF相关GATA6基因新突变，有助于TOF的早期防治。