Flag与GFP双标记人微粒体甘油三酯转移蛋白重组腺病毒载体的构建与表达

目的利用重组腺病毒(adenovirus,ad)技术Adeasy系统构建带绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)和Flag双标记的人类微粒体甘油三酯转移蛋白(human microsomal triglyceridetransfer protein,hMTP)基因重组腺病毒载体,并包装成高滴度的腺病毒。方法自人HepG2细胞获得RNA,以RT-PCR和Nested PCR扩增hMTP-flag基因。PCR产物经测序证实后插入穿梭质粒GFP-Track。经PmeI酶切线性化后,共转化到含腺病毒骨架质粒Adeasy的感受态细菌BJ5183。筛取阳性克隆,经PacI酶切线性化后转染293A细胞,产生包装病毒颗粒,并传代扩増培养。结果经测序证实得到hMTP-flag-GFP基因,限制性内切酶证实同源重组腺病毒包含目的基因。荧光显微镜下可见GFP的高效表达,Western-blot检测可见97KD目的条带(hMTP分子质量为97KD)。结论成功构建含hMTP-flag-GFP基因的双标记重组腺病毒载体,并进行蛋白质表达,为进一步研究脂蛋白的功能打好了坚实基础。

瘦素和载脂蛋白E基因共同缺陷促进糖尿病动脉粥样斑块形成

目的通过瘦素基因缺陷的肥胖型Ⅱ型糖尿病小鼠与ApoE基因敲除(ApoE Knockout)的高胆固醇血症合并动脉粥样硬化的小鼠进行杂交,产生混合性高甘油三酯血症和高胆固醇血症并较单纯ApoE基因敲除小鼠具有更明显的血管动脉粥样硬化。方法采用杂交、回交、互交的方法进行培育,提取小鼠尾部基因组DNA进行PCR分析和血浆脂质测定,并从大体病理标本上,主动脉纵切面观察比较血管动脉粥样硬化情况。结果通过上述培育方法,成功得到Leptin及ApoE双基因敲除小鼠。成年小鼠表现为极度的混合型高脂血症,其血浆甘油三酯和胆固醇水平是正常小鼠的2.6倍和8.6倍,其主动脉血管粥样硬化斑块较单纯ApoE基因敲除小鼠更为明显。结论成功培育了Leptin/ApoE双基因敲除的遗传性混合型高甘油三酯、高胆固醇血症小鼠并具有更明显的动脉粥样硬化斑块。