显微镜观察药物敏感度检测技术在二线抗结核药耐药性检测中应用

目的探讨MODS同时快速检测4种二线抗结核药耐药性的效果。方法用24孔细胞培养板建立显微镜观察药物敏感性技术，进行二线抗结核药物耐药性检测，并对最佳检测条件进行探讨。将该技术用于上海市肺科医院2007-2008年住院肺结核患者痰标本分离60株结核分枝杆菌对丙硫异烟胺、阿米卡星、卷曲霉索、左氧氟沙星耐药性检测，并与传统罗氏药敏结果进行比较，对2种方法检测结果不符的菌株进行MIC测定。结果MODS检测丙硫异烟胺、阿米卡星、卷曲霉素、左氧氟沙星药敏结果与罗氏药敏结果符合率分别为96．7％（58／60）、98．3％（59／60）、91．7％（55／60）、96．7％（58／60）。以传统罗氏药敏结果为判断金标准，MODS检测敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值及准确性丙硫异烟胺分别为100％、87．5％、87．5％、100％、96．7％，阿米卡星分别为100％、90．0％、90．0％、100％、98．3％，卷曲霉素分别为76．9％、95．7％、83．3％、93．8％、91．7％，左氧氟沙星分别为100％、96．0％、83．3％、100％、96．7％。结论MODS检测丙硫异烟胺、阿米卡星、卷曲霉素、左氧氟沙星耐药性具有快速、操作简便、价廉等优点，与传统罗氏药敏结果有较高的符合率，可作为MTB耐药性的快速检测方法之一。

结核分枝杆菌分泌蛋白64抗体适体的获得及血清学检测

指数级富集配体的系统进化 （ systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX） 技术筛选的适体具有可体外合成、纯度高、稳定性强和易于保存等特点，并已用于检测多种靶物质。目前利用适体检测MTB分泌蛋白64（MPT64）及模拟胸腔积液中γ干扰素含量已有报道，由于MPT64是结核病血清学诊断的重要抗原之一，

氯法齐明对不同耐药类型结核分枝杆菌的体外抑菌活性研究

目的评价氯法齐明对不同耐药类型的MTB临床分离菌株的体外抑菌活性，为临床应用提供依据。方法应用微孔板观察法，测定氯法齐明对MTB标准株H，，Rv及临床分离敏感、单耐药、多耐药、耐多药和广泛耐药菌株各15株的MIC，并将氯法齐明对不同耐药类型的MTB菌株体外活性与异烟肼、利福平、阿米卡星、卷曲霉素和氧氟沙星进行比较。结果氯法齐明对敏感菌株的MIC（0．06～4．00mg／L）高于异烟肼（0．06—0．25mg／L）和利福平（0．06—0．25mg／L），与氧氟沙星（0．06．2．00mg／L）、阿米卡星（0．06—4．00mg／L）和卷曲霉素（0．50～4．00mg／L）相似；氯法齐明对单耐药菌株的MIC（O．03～4．00mg／L）与异烟肼（0．06～0．25mg／L）和利福平（0．06～0．25mg／L）相似，低于氧氟沙星（0．25—8．00mg／L）、阿米卡星（0．06～4．00mg／L）和卷曲霉素（0．50～8．00mg／L）；氯法齐明对耐多药菌株的MIC（0．06～8．00mg／L）与阿米卡星（0．25～8．00mg／L）相似，优于氧氟沙星（0．125～8．00mg／L）和卷曲霉素（0．50～8．00mg／L）；氯法齐明对广泛耐药菌株的MIC（0．03～8．00mg／L）明显优于其他药物。结论氯法齐明对MTB菌株，尤其是耐多药和广泛耐药MTB菌株，均有较好的体外抑菌活性。

分泌蛋白MPT64鉴定结核分枝杆菌复合群的应用研究

目的构建重组MTB分泌蛋白MPT64，制备多克隆抗体，评价其在鉴定MTB复合群中的应用价值。方法通过PCR扩增mpt64基因，构建pET21a—mpt64重组质粒；纯化重组蛋白并免疫兔制备多克隆抗体；纯化和标记抗体，建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）方法；检测分枝杆菌标准菌株和临床分离株培养液中MPT64蛋白，抽提样本基因组扩增mpt64基因。结果成功构建重组质粒，纯化重组蛋白并制备多克隆抗体，检测抗体浓度为0．85g／L，ELISA法检测敏感度为0．01mg／L，MTB复合群中H37Rv、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌为阳性，24株非MTB均为阴性；rapt64基因扩增的结果与ELISA法检测结果完全相符。ELISA法检测MTB临床分离株的敏感度为97．3％（110／113），57株非MTB均未检出MPT64蛋白，检测特异度为100．0％。基因扩增MTB中2株为阴性，非MTB均为阴性。结论采用ELISA法检测分泌蛋白MPT64来鉴定MTB复合群，是一种准确、快速和简便的方法，值得临床推广应用。

鉴别结核分枝杆菌复合群的新型核酸扩增检测靶标评价

目的寻找新的鉴别诊断MTB复合群（MTC）高特异度和敏感的核酸靶标。方法利用简单序列重复区间（ISSR）分型技术平台筛选MTC的特征片段，克隆测序获得特征序列并进行序列同源性分析，以该序列为基础设计MTC特征引物，并对211株分枝杆菌菌株（其中MTC107株、非结核分枝杆菌104株）进行鉴别检测。利用分枝杆菌属特征序列16s rRNA和MTC特征序列IS6110的鉴别结果，对MTC特征引物检测结果进行评估。结果通过ISSR分型获得588bp的MTC特征片段，该序列为MTC菌株的特征序列，位于MTB标准株H37Rv基因组的315947-316534位，以该序列为基础设计MTC鉴别引物MTCF／R，16srRNA基因在211株分枝杆菌菌株中的扩增结果均为阳性，IS6110序列在107株MTC菌株中扩增阳性率为99％（106／107），在104株NTM菌株中阴性检出率为100％（104／104），MTCF／R引物在MTC菌株中的扩增阳性率为100％（107／107），在非结核分枝杆菌菌株中的阴性检出率为100％（104／104）。结论通过ISSR分型技术筛选出的MTC特征序列可作为新的核酸扩增靶标用于MTC和非结核分枝杆菌的鉴别诊断。

环丝氨酸在健康大鼠肺组织中的药代动力学研究

环丝氨酸为新型二线抗结核药物，主要与其他药物联用于耐多药结核病的治疗。环丝氨酸通过抑制D一丙氨酸消旋酶和合成酶，抑制细菌细胞壁黏肽的形成，导致MTB细胞壁缺损，从而起到杀菌和抑菌作用[1-2]。我们对环丝氨酸在肺部的药代动力学进行了初步研究。

一种五联重复序列在分枝杆菌简单序列重复区间分型中的应用研究

目的分析微卫星5联简单重复序列在分枝杆菌基因组中的分布情况，并评价其简单序列重复区间（ISSR）分型能力，为分枝杆菌的基因分型及流行病学研究提供新的研究工具。方法实验菌株为17株分枝杆菌菌株和41株MTB临床分离株，17株分枝杆菌菌株包括分枝杆菌标准株15株、MTB临床菌株1株和MTB无毒株（H37Ra）1株。利用MICdb2．0软件分析微卫星数据库收录的分枝杆菌基因组中5联简单重复序列（CAGCG）n的分布特征，并以该序列为基础设计ISSR引物（5’-CAGCGCAGCGCAGCG-3’），用于分枝杆菌种间和种内菌株的基因分型分析。结果生物信息学分析显示（CAGCG）n在数据库收录的大部分分枝杆菌基因组中均有较高含量，其中在H37Rv、CDCl551、牛分枝杆菌和鸟分枝杆菌基因组中出现的次数分别为40、39、39和33次，且主要分布在编码序列区（分别为39、36、38和30次）。ISSR引物对分枝杆菌菌种的基因分型分析显示，15种常见菌种聚为2大簇，第1簇含有2个亚型，第2簇含有4个亚型，种间表现出高度的遗传多样性；ISSR引物对MTB临床菌株的分析结果显示，41株菌株聚为2簇，各簇分别有2个亚型，提示该引物对种内菌株也表现出良好的分辨力。结论以（CAGCG）n建立的ISSR分型体系，可用于分枝杆菌种间和种内菌株的遗传多样性分析。