液体培养基比色法快速检测结核分枝杆菌耐药性

目的探讨液体培养基比色法在结核分枝杆菌(MTB)耐药性快速测定中的应用价值。方法将MTB分别接种于含药和不含药的液体培养基中,37℃培养6d,然后加入NaNO3试剂,37℃培养1d,进行硝酸盐还原检测试验。根据液体培养基颜色变化情况,判断药敏结果。将检测结果与Bactec-960测定结果比较,分析硝酸盐还原酶比色法检测MTB耐药性的敏感性、特异性和准确性。结果以Bactec-960检测结果为判断标准,液体培养基比色法检测链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇耐药性结果与Bactec-960的符合率分别为100.0%、96.9%、98.1%和97.5%。结论液体培养基比色法检测MTB耐药性具有很高的敏感性和特异性,且需时较短、操作简便、结果准确、不需特殊仪器设备,可作为MTB耐药性的快速筛选方法。

噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌阿米卡星耐药性方法的建立及应用评价

目的建立结核分枝杆菌阿米卡星(Am)耐药性的噬菌体生物扩增法(PhaB)快速检测技术,并探讨其临床应用价值。方法通过不同菌量及药物浓度的筛选,建立PhaB测定结核分枝杆菌阿米卡星药敏检测方法;用该方法对108株结核分枝杆菌临床分离株进行了阿米卡星药敏检测,同步进行Bactec-MGIT 960的Am药敏检测,对2种方法的检测结果进行比较分析。结果不符合的菌株测定其Am的最低抑茵浓度(MIC)。结果以细菌接种量10-3mg/ml、药物浓度2μg/ml、37℃作用48 h为药敏最佳检测条件,噬菌体检测108株结核分枝杆菌临床分离株阿米卡星敏感82株、耐药26株,Bactec MGIT 960检测敏感80株、耐药28株;2法测定均为敏感79株、均为耐药25株。以Bactec MGIT 960测定结果为判断标准,则PhaB的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值及符合率分别为89.3%、98.8%、96.2%、96.3%、96.3%。结论 PhaB检测结核分枝杆菌的Am耐药性有较高的敏感性、特异性和准确性,整个检测只需3 d,且操作简单、不需特殊仪器设备,可作为M.TB临床分离株Am药敏快速检测备选方法之一。

结核分枝杆菌CE复合物对人单核-巨噬细胞的功能表型的影响及其作用机制

目的研究结核分枝杆菌早期分泌抗原CFP-10-ES-AT-6复合物（CE复合物）对人单核-巨噬细胞功能表型的影响及其作用的细胞信号传导通路。方法分别采用ELISA法以及流式细胞仪检测大肠杆菌克隆表达纯化的CE复合物在不同时间及浓度对人单核-巨噬细胞TNF-α产生对细胞表型的影响，并且应用各种细胞信号传导通路抑制剂来探讨CE复合物作用的细胞信号传导通路。结果结核分枝杆菌CE复合物能够在早期（6～8h）诱导人单核-巨噬细胞活化，大量产生TNF-α，但在晚期（〉48h），则没有此作用；细胞信号传导通路MEK1／2和p38 MAPK的选择性抑制剂SB203580、PD98059、U0126能抑制CE的这种作用；CE复合物在早期（18h）促进单核-巨噬细胞表面抗原提呈功能分子CD80、CD40的表达。结论CE复合物在感染早期可能通过激活MEK1／2和p38MAPK刺激单核巨噬细胞活化，但在晚期则没有此作用。在感染早期可能具有重要的抗结核保护作用。

肺外结核病的实验室诊断技术应用

肺外结核病是指发生于肺部以外的全身其他脏器的结核病，由于病变部位广，临床表现复杂多样，早期诊断较为困难，误诊、漏诊率较高。鉴于实验室检查对肺外结核的诊断具有重要意义，因此快速、灵敏的实验室诊断技术研究极为重要。

加强结核病实验室诊断和耐药性检测新技术的研究和应用

结核病实验室诊断和耐药性检测技术研究一直是国内外同道关注的焦点内容。但是现行的结核病细菌学涂片检查敏感性低，常规培养需4～8周，快速仪器培养法也需2—6周，远不能满足临床快速诊断的需求。因此，快速、灵敏的结核病实验室诊断和耐药性检测新技术研究及其应用迫在眉睫。近年来，国外一些高水平杂志相继发表了一些在结核病诊断和耐药性检测中的新技术应用文章，备受国内外学者关注。

耐多药结核病化疗研究的新进展

耐多药结核病（multidrug—resistant tuberculosis，MDR—TB）的流行与传播给全球公共卫生所带来的影响已逐步显现，MDR—TB的防治形势也变得越来越复杂。近年来，广泛耐药结核病（extensively drug resistant tuberculosis，XDR—TB）的出现使得全球结核病控制工作雪上加霜。因此，研究优化的MDR—TB化疗方案，以提高MDR—TB的治愈率，阻断其向更为难治的XDR—TB发生与发展迫在眉睫。最近，国外有关MDR-TB治疗的研究较为深入，其中不乏值得我们借鉴的经验与精髓，仔细拜读，颇有收益，愿与广大同道分享。

结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定

目的利用指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子，寻找早期诊断结核病的方法。方法体外合成随机单链DNA（ssDNA）文库，以MPT64蛋白为靶物质，采取SELEX技术进行12轮筛选，将适配子库克隆、测序后，用DNAMAN软件对其结构进行分析，经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力，并利用捕获适配子与检测适配子组成的“三明治”夹心法对获得的适配子进行初步验证。将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0，将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1，采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线，确定最佳阳性判定值，并构建散点图。结果经12轮筛选后，随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析，吸光度值为0．492—1．243，73．3％的适配子的吸光度值在1．0以上；二级结构分析显示，适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构，口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对；“三明治”夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗（BCG）株]和阳性组（结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株）共47个菌株培养上清的检测结果显示，在临界（cut-off）值为0．61时，H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性，BCG株为阴性；阴性组标本的阴性检出率为85．7％，阳性组标本的阳性检出率为87．9％，表现出一定的检测价值。结论已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子。

结核分枝杆菌分泌蛋白64抗体适体的获得及血清学检测

指数级富集配体的系统进化 （ systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX） 技术筛选的适体具有可体外合成、纯度高、稳定性强和易于保存等特点，并已用于检测多种靶物质。目前利用适体检测MTB分泌蛋白64（MPT64）及模拟胸腔积液中γ干扰素含量已有报道，由于MPT64是结核病血清学诊断的重要抗原之一，

非结核分枝杆菌肺病治疗面临的难点与困惑

非结核分枝杆菌 （ nontuberculoas mycobacteria, NTM ）肺病是最常见的NTM病。近年来，由于获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）流行及实验室检测手段提高等因素，NTM肺病的发病率呈增多趋势，在不少国家和地区已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。然而，由于大多数NTM对常用的抗分枝杆菌药物耐药，NTM肺病治疗面临诸多的难点与困惑，并引起广大临床医生的关注和重视。一、对NTM肺病治疗还是不治疗目前对NTM肺病治疗与否存在争议，其焦点主要在治疗效果多不确切、治疗费用较高及易引起不良反应，导致投入与收益不成比例。

北京基因型结核分枝杆菌感染的相关因素分析

目的研究感染北京基因型MTB菌株的危险因素及其与耐药和临床症状的相关性。方法2007年9月至2008年3月痰涂片阳性怖结核患者172例（男132例，女40例），平均年龄（56±10）岁。收集痰标本，采用罗氏培养法，培养阳性菌株行DNA提取，使用基因RD105缺失法及7个位点可变数量串联重复序列（VNTR-7）方法进行基因分型。两组间率的比较采用χ^2检验，定量资料比较采用t检验。结果172例痰标本中共得到培养阳性菌株116株，其中非MTB菌株4株，MTB菌株112株。来自上海及江浙地区的MTB菌株中北京基因型占86．6％（84／97），非北京基因型占13．4％（13／97）。女性患者的北京基因型（31／84，36．9％）明显高于非北京基因型（1／13，7．7％），初治患者中CD4／CD8〈1者北京基因型（17／41，41．5％）明显高于非北京基因型（0／7，0％），差异均有统计学意义（χ^2值分别为4．436和4．494，均P〈0．05）。采用VNTR-7分型方法，北京基因型菌株可分为31种基因型，各型之间的分布不均匀，有4种基因型集中了47．6％（40／84）的MTB菌株及43．6％（17／39）的耐药菌株。结论上海及江浙地区的MTB菌株以北京基因型为主，女性及免疫功能低下的初治肺结核患者可能是感染北京基因型菌株的危险因素。北京基因型菌株与耐药及临床症状可能无明显相关性。

人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库的构建

目的构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库，为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础。方法从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因，然后拼接装配成单链抗体基因，重组于噬菌粒载体pCANTAB5S，转化大肠埃希菌E．coli TG1，以辅助噬菌体拯救后，构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库。结果成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库，库容量达10^7。结论以结核患者淋巴细胞免疫球蛋白可变区基因片段和噬菌粒展示载体pCANTAB5S为基础，成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库，并达到建库标准，可进一步从中筛选获得结核特异性单链抗体。

显微镜观察药物敏感性检测技术及其在结核病诊断和耐药性检测中的应用

自20世纪80年代以来，结核发病率又呈上升趋势，据WHO估计，全球约有20亿人患有结核病，每年有880万新发病例，死亡人数约为200万。同时，耐药结核病也随之增多，使结核病的诊断及治疗变得更为困难。传统的结核病细菌学检查和耐药性测定尽管是结核病实验室诊断的金标准，但是敏感度差、且需时较久，或费用昂贵，远不能满足临床诊治的需求。因此，新的结核病诊断和耐药性检测技术一直是国内外学者探索的焦点。2000年Caviedes等建立了一种新的结核病诊断及耐药性检测技术——显微镜观察药物敏感度检测技术（microscopic observation drug susceptibility，MODS），随后该技术发展迅速，应用报道文献日益增多。现将MODS技术及其在结核病的诊断和耐药性检测进展综述如下。

结核分枝杆菌培养滤液蛋白32的克隆表达及血清学检测

目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白32（culture filtrate protein32，CFP32）的重组质粒，在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白CFP32，探讨其对结核病的诊断价值。方法通过聚合酶链反应技术从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出Rv0577基因，将其克隆到pMDl8一T载体后，再亚克隆到表达载体pET21a，在大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，经纯化及复性后，通过Western blot分析，并以酶联免疫吸附试验检测160例血清抗体，其中肺结核患者97例、非结核肺部疾病患者25例，正常对照38名。结果构建了CFP32重组质粒，并在大肠杆菌中进行了高效表达，表达蛋白经SDS—PAGE分析，在约相对分子质量30000处有表达条带，镍柱纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。Western blot证实重组蛋白可以与结核患者血清特异结合。并以此蛋白进行160份血清结核抗体检测，结果敏感度为63．9％（62／97），特异度为96．8％（2／63）。结论成功构建pET21a—CFP32表达载体，并在大肠杆菌中高效表达CFP32蛋白，对其血清抗体检测证明重组的CFP32蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。

噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌及其耐药性方法评价

1997年，Wilson等建立了噬菌体生物扩增法（PhaB），并将其用于结核分枝杆菌（MTB）耐药性测定。随后，又有学者将其用于结核患者痰标本的快速检测。我们分析了该技术在MTB诊断和耐药性测定方面的相关报道，综述如下。

噬菌体生物扩增法和最低抑菌浓度法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性

目的探讨噬菌体生物扩增法(PhaB)和液体培养基最低抑菌浓度法(MIC)检测结核分枝杆菌(MTB)氧氟沙星(OFX)耐药性的临床应用价值。方法应用两种方法同时检测90株MTB临床分离株OFX耐药性,并与绝对浓度法比较检测结果的敏感性、特异性及准确性。结果90株MTB临床分离株用绝对浓度法、MIC、PhaB三种方法分别测得70株、60株、67株敏感株和20株、30株、23株耐药株。若以绝对浓度法测定结果为判断标准,则PhaB检测OFX耐药性的敏感性、特异性和准确性分别为85.0%、91.4%和90.0%;MIC检测的敏感性、特异性和准确性分别为100.0%、85.7%和88.9%;若以绝对浓度法和MIC测定结果为判断标准,则PhaB检测的敏感性为85.0%,特异性为98.3%,准确性为95.0%。结论PhaB检测OFX耐药性有较高的敏感性和特异性,只需要3 d,且操作简单、不用特殊仪器设备,可作为OFX耐药性的快速筛选方法;液体培养基MIC测定OFX耐药性平均需要20 d,不能满足快速药敏试验需要。

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增出MPT64基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET21a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠杆菌BL21,诱导表达MPT64融合蛋白,利用亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE电泳进行鉴定。结果成功构建MPT64表达载体,SDS-PAGE电泳鉴定成功表达MPT64蛋白。并以此蛋白进行结核抗体的检测,其特异性和敏感性分别为96%和43%。结论成功表达结核分枝杆菌MPT64蛋白,并进行特异性和敏感性的检测,证明重组的MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一。

耐药结核病的诊断与治疗新进展

世界结核病防治日是一个旨在全球范围内动员公众支持、加强结核病防治的日子，定于每年3月24日。这个年度活动是为了纪念1882年德国微生物学家罗伯特·科霍发表他对结核病病原菌的发现，此举向诊断和治疗结核迈出了第一步。世界卫生组织于1993年在英国伦敦召开的第46届世界卫生大会通过了“全球结核病紧急状态宣言”，并积极宣传此病防治的重要。

“非结核分枝杆菌病的诊断、治疗和预防＂读后有感

近年来，随着获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）的流行，非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）播散性感染日趋增多，这已成为艾滋病患者全身性细菌感染的常见原因。多项流行病学调查结果表明，部分国家人免疫缺陷病毒（HIV）阴性人群中NTM患者增多。因此，NTM病已成为公共卫生性疾病，越来越受到重视。

细胞因子基因多态性与结核病易感性研究进展

结核病是发展中国家常见的疾病，病死率高。全球有近三分之一的人口感染结核分枝杆菌，但仅有10％的感染个体最终发展为临床结核，说明宿主的基因因素在结核病的发病机制中起着极其重要的作用。细胞因子是结核病免疫的重要组成部分，其水平与结核病易感性、严重程度和临床表现都有联系，因此编码细胞因子的基因在结核病易感性中有重要的作用。现就细胞因子基因多态性与结核易感性的关系作一综述。

变性高效液相色谱检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇的耐药性

乙胺丁醇(EMB)的初始耐药率与获得性耐药率均超过1%[1].研究发现,在耐受EMB的菌株中,约60%发生embB基因306位点突变[2].因此,该点突变的检测对结核分枝杆菌(MTB)耐受EMB的临床诊断具有重要意义.