转化生长因子-β1对小鼠肝纤维化的促进作用

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对实验性小鼠肝脏细胞发生上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的促进作用,进而加速肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的形成。方法建立小鼠CCl4诱导HF模型,随机分为正常对照组、HF组与TGF-β1处理组。取对数生长期肝细胞,0.25%胰蛋白酶液消化细胞,0.4%FBS/DMEM同步化处理24 h后,按TGF-β1 2.5、5、7.5 ng/ml作用24、96、144 h分组给予相应处理,相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞组织化学及免疫荧光方法对细胞表型进行鉴定。RT-PCR及Western blot检测EMT[成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast specific protein-1,FSP-1),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),E-钙黏附素(E-cadherin,E-cad)]mRNA及蛋白表达情况。结果将含有TGF-β1无血清培养基刺激原代小鼠肝细胞48 h后可见较多肝细胞死亡,细胞数量减少,形态由多边形向梭形转变,96 h后小鼠肝细胞内出现凋亡小体,活细胞数量较少且大多数呈现间质细胞梭形形态。5 ng/ml的TGF-β1作用肝细胞96 h后,小鼠肝上皮细胞标志(E-cad)mRNA及蛋白表达逐渐减低,肝间质细胞标志(FSP-1和α-SMA)mRNA及蛋白表达逐渐升高(P<0.05)。结论 5 ng/ml的TGF-β1作用于HF的小鼠肝细胞96 h后,肝细胞发生EMT现象,TGF-β1有促进实验小鼠肝细胞的迁移、侵袭能力及细胞凋亡的作用,进而发生EMT导致HF。

分泌型卷曲相关蛋白抑制实验性小鼠肝纤维化的研究

目的探讨分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled related protein,SFRP)对实验性小鼠肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)的抑制作用。方法建立小鼠CCl4诱导HF模型,随机分为正常对照组、HF模型组与SFRP2 shRNA处理组。小鼠肝细胞中获得总RNA,经RT-PCR转化cDNA,构建pcDNA1.0/SFRP2载体HF肝细胞并克隆获得pSilencerU6neo/SFRP2 shRNA稳定转染肝细胞。采用Westernblot、免疫荧光显微镜及激光共聚焦定位分析观察SFRP2 shRNA抑制HF作用。结果免疫双荧光显示SFRP2shRNA抑制HF小鼠肝细胞FSP-1 mRNA、Smad2 mRNA、Wnt3A mRNA的表达;经RT-PCR及Westernblot分析支持SFRP2 shRNA抑制HF小鼠肝细胞上皮-间质转换(Epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的发生(P<0.05);流式细胞仪分析表明SFRP2shRNA有缓解HF小鼠肝细胞凋亡的作用。结论我们研究证实SFRP在实验性小鼠肝上皮细胞中可能通过下调内源的某些自分泌信号抑制因子,抑制EMT程序,从而缓解HF。

分泌型卷曲相关蛋白重组腺病毒载体对小鼠肝纤维化的抑制作用

目的:成功构建携带分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled related protein,SFRP)基因的腺病毒载体,并探讨SFRP对实验性小鼠肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的抑制作用.方法:用脂质体转染法将重组腺病毒pAdTrack-PPARγ2-CMV和SFRP5基因共转染CCl4诱导小鼠HF模型肝细胞,成功构建的重组腺病毒Ad-SFRP5感染HF细胞.采用Western blot、免疫荧光显微镜及激光共聚焦定位分析观察Ad-SFRP5抑制HF作用.结果:感染的重组腺病毒载体在小鼠HF细胞中有较高的SFRP5蛋白的稳定表达.免疫双荧光显示Ad-SFRP5抑制HF小鼠肝细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和成纤维细胞特异蛋白-1(fibroblastspecific protein-1,FSP-1)的表达.病理检测支持Ad-SFRP5抑制HF小鼠肝细胞上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的发生(SFRP5处理组与正常对照组相比,P<0.05).结论:我们成功构建含有小鼠SFRP5基因的重组腺病毒,他可有效提高小鼠HF细胞中SFRP5基因的表达水平,并可抑制EMT程序,从而抑制HF.