微小RNA-26b在乳腺癌中的作用及其分子机制研究

目的研究微小RNA-26b(miR-26b)在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达以及对乳腺癌MBA-MD-231细胞增殖的影响,并分析其可能的机制。方法选取上海市同济大学附属第十人民医院甲乳外科2010年1月—2012年5月行手术治疗的38例女性乳腺癌患者的乳腺癌组织,并取距离肿瘤组织>5 cm正常乳腺组织。运用荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测乳腺癌组织和正常乳腺组织中miR-26b的表达量。运用MTT法分析miR-26b对乳腺癌MBA-MD-231细胞增殖的影响,采用50、100 nmol/L miR-26b mimics转染为50 nmol/L组和100nmol/L组,脂质体处理为空对照组,小分子RNA片段转染为负对照组,转染后24、48、72、96 h分别测定细胞相对增殖情况。通过TargetScan软件寻找miR-26b可能靶基因〔前列腺素内过氧化物酶2(PTGS-2)〕,并应用荧光素酶报告实验和Western blotting技术进行验证。结果乳腺癌组织中miR-26bΔCt为(15.25±0.98),正常乳腺组织中为(12.37±1.23),正常乳腺组织中miR-26b表达水平为乳腺癌组织的7.33倍,乳腺癌组织中miR-26b表达低于正常乳腺组织(t=12.21,P=0.007)。MTT实验结果显示,50 nmol/L组、100 nmol/L组、空对照组和负对照组转染后72、96 h相对细胞增殖比较,差异均有统计学意义(F值分别为11.037和5.470,P值分别为0.003和0.024);其中转染后96 h 50 nmol/L组较空对照组降低(q=-3.048,P=0.038);转染后72 h和96 h 100 nmol/L组较空对照组降低(q值分别为-3.248和-4.254,P值分别为0.031和0.013)。荧光素酶报告实验结果显示,PTGS-2组、突变体对照组及空载体对照组荧光素酶活性比较,差异有统计学意义(F=99.88,P=0.000);其中PTGS-2组较突变体对照组和空载体对照组降低(q值分别为-10.314和-12.108,P值分别为0.000和0.000)。Western blotting结果显示,与空对照组和负对照组相比,实验组PTGS-2 mRNA和蛋白的表达量明显减少。结论 miR-26b在乳腺癌组织中呈低表达,其可能通过作用于下游基因PTGS-2抑制乳腺癌细胞的增殖,miR-26b在肿瘤发生发展中可能担任着抑癌基因的角色。

CKII抑制剂——肝癌治疗新靶点

目的探讨蛋白激酶(casein kinase 2,CK2)抑制剂影响肝癌细胞株HepG-2凋亡的机制,为其临床治疗肝癌提供可能的实验依据。方法本研究通过MTT法和流式细胞仪检测和观察不同作用时间、不同浓度CK2抑制剂四溴苯三唑(4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole,TBB)作用HepG-2肝癌细胞株后对其增殖和凋亡的影响,分别应用荧光定量PCR和Western blot实验分析可能机制。结果 TBB在48 h浓度为200μmol/L时对肝癌细胞的抑制作用最明显;150μmol/L TBB作用48 h后,早期凋亡率明显增高,至(13.2±0.67)%,磷酸化P65在100μmol/L TBB实验组表达下调,而caspase-3、caspase-8、Bcl-2和Bcl-x等在两组间表达未见明显差异。结论 CK2抑制剂TBB能够通过参与调控NF-κB信号转导通路抑制肿瘤细胞增殖,促进其凋亡,可能成为未来肝癌治疗的一个新的靶点。

adaboost分类器的构建及其对肝癌非编码区有害突变的鉴定

目的建立adaboost分类器模型,评估肝癌非编码区疾病相关突变的可能性,识别非编码区的有害突变。方法利用人类基因突变数据库(HGMD)疾病相关的非编码区突变共13 108个作为实验组,中性单核苷酸多态性(SNP)作为对照,结合非编码区的调控因子,如保守区、进化性的RNA保守结构、高表达基因、DNA酶Ⅰ超敏感位点、转录因子结合位点、组蛋白修饰和早期复制基因等指标,建立adaboost分类器,分析以上指标对预测非编码区中有害突变的价值。构建预测概率的受试者工作特征(ROC)曲线,计算其相应的ROC曲线下面积(AUCROC)。分别利用全基因组关联研究(GWAS)和Clin Var疾病相关的突变数据库对模型进行验证。结果对疾病相关突变鉴别的重要性由大到小分别是保守区、早期复制基因、非翻译区(UTR)、启动子、高表达区、H3K36me3和保守性的转录因子结合位点等。应用adaboost分类器的预测概率建立ROC曲线,其AUCROC为0.90。GWAS和ClinVar疾病相关突变的平均得分显著高于中性SNP(P<0.05)。结论adaboost分类器有助于评估肝癌非编码区有害突变的可能性,是一种准确率高的预测工具。

微小RNA-200a在肝癌中的表达及其功能

目的观察miR-200a在肝癌细胞HepG2和正常肝细胞QSG-7701中的表达,以及对肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡、周期和侵袭能力的影响。方法运用荧光定量PCR检测肝癌细胞HepG2和正常肝细胞QSG-7701中的miR-200a的表达量。运用MTT法、流式细胞仪和Transwell试验分析miR-200a对细胞增殖、周期、凋亡和侵袭能力的影响。结果肝癌细胞HepG2中miR-200a表达水平为正常肝细胞4.79倍,癌细胞中miR-200a表达明显高于正常细胞(P<0.01)。在72 h浓度为150 nmol/L时,miR-200a对肝癌细胞增殖的促进作用最明显,促进率为38.40%。与空对照组和负对照组比较,G0/G1期细胞未见明显增多(57.13±0.02)%,S期无明显减少(26.55±0.8)%,早期凋亡细胞比例未见明显升高(0.5±0.06)%(P>0.05)。Transw ell实验结果显示100 nmol/L miR-200a mimics实验组相对穿出小室膜肿瘤细胞数为(0.348+0.005 657),与空对照组(0.296±0.006 364),负对照组(0.287±0.005 364)差异明显(P<0.05)。结论 miR-200a在肝癌细胞株中异常表达,癌细胞中的表达明显高于正常细胞,miR-200a对肝癌细胞株的增殖和侵袭能力有着明显的促进作用,其在肿瘤发生发展中可能担任着原癌基因的角色。

微小RNA-518b在乳腺浸润性导管癌中的表达及其功能

目的观察miR-518b在乳腺癌中的表达，以及对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖、细胞周期、凋亡和侵袭能力的影响。方法运用定量逆转录聚合酶链反应（PCR）检测乳腺癌及正常组织中miR-518b的表达量，结合临床病理资料，分析其异常表达与各病理因素的相关性。并运用噻唑蓝（MTr）比色法了解其增殖，流式细胞仪分析细胞的周期、凋亡，Transwell实验观察其对细胞侵袭能力的影响。结果乳腺癌组织中miR-518b表达水平为2．751585±5．856351，正常组织中为7．334841±9．843424，癌组织中miR-518b表达明显低于正常组织（P〈0．01）。miR-518b在乳腺癌中的表达异常与淋巴结转移相关（P〈0．01），与病理分期、肿瘤大小、原癌基因人类表皮生长因子受体2（HER-2）、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、pS3无明显相关性。在48h浓度为150nmoVL时，miR-518b对乳腺癌细胞的抑制作用最明显，抑制率为59．9％。与空对照组和负对照组比较，G0／G1期细胞未见明显增多（75．52±1．78）％，S期无明显减少（9．52±0．91）％，早期凋亡细胞比例未见明显升高（2．60±0．06）％（P〉0．05）。Transwell实验结果显示随着miR-518bmimics浓度的增加，穿出小室膜肿瘤细胞大致呈递减趋势，并与对照组差异明显（P〈0．01）。结论miR-518b在乳腺癌患者中异常表达，癌组织中的表达明显低于正常组织，miR-518b对乳腺癌细胞株的增殖和侵袭能力有明显抑制作用，其在肿瘤发生发展中可能担任着抑癌基因的角色。