E-cadherin重组慢病毒载体的构建及表达

[目的]构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,转染A549肿瘤细胞,观察E-cadherin的表达。[方法]根据Gene Bank E-cadherin的序列,选择设计两条序列和一条无关RNAi序列作为对照,通过Mlu I和Nde I两个酶切位点,将设计好的siRNA片段插入包装质粒PHR-SIN-CSGW-H1a(PHR)构建E-Cadherin RNAi慢病毒载体PHR-EA、PHR-EB。PCR扩增E-cadherin基因与pc DNA3.1质粒使用Bam HI、Xho I双酶切,连接鉴定后,亚克隆至慢病毒载体PHR,构建-E-cadherin过表达慢病毒载体PHR-E-cadherin。慢病毒包装后,感染A549肿瘤细胞,观察表达。[结果]成功构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,并分别经PCR和质粒酶切鉴定。RTPCR检测E-cadherin的干扰和过表达情况,两个E-cadherin的RNAi病毒感染细胞后,都能使目的基因表达下调,而E-cadherin过表达慢病毒转染后细胞的E-cadherin表达明显提高了。Western Blot检测证实E-cadherin的表达确实被慢病毒所上调和干扰。[结论]成功构建出E-cadherin基因过表达和RNAi慢病毒载体,并在A549肿瘤细胞中成功表达,为进一步转染神经干细胞观察其生物学影响及对脊髓损伤修复的效果奠定基础。