菌阴肺结核的实验室诊断研究进展

一、菌阴肺结核的细菌学含义传统的菌阴肺结核是指痰涂片和培养检查分枝杆菌均为阴性的肺结核患者。在肺结核病人中,大约有50%～70%的病人痰中检查不出结核菌,即所谓菌阴肺结核。由于菌阴肺结核的诊断缺乏“金标准”,诊断困难,极易发生漏诊、误诊、漏治、误治、过治,不仅给病人增加了负担,还给社会带来负担和危害。因此,如何准确对菌阴者进行诊断和治疗,是亟待解决的一个难题。

TB-SA结核抗体检测的临床应用评价

目的评价结核分枝杆菌TB-SA抗体检测在结核病诊断中的应用效果。方法对440例结核病、非结核病的其他呼吸系统疾患患者及健康体检者同步进行抗酸杆菌涂片、培养及结核分枝杆菌TB-SA抗体检测。结果285例临床诊断的活动性结核患者,TB-SA抗体检测阳性199例,阳性率69.8%,检测58例非结核患者,假阳性7例,假阳性率12.1%,检测97例健康对照,假阳性13例,假阳性率13.4%;检测菌阳肺结核的敏感性为72.7%,菌阴肺结核的敏感性为66.9%;阳性检出率69.9%远远高于细菌学阳性检出率52.3%,2χ=17.2,P<0.001,具有统计学意义。结论结核分枝杆菌TB-SA抗体检测诊断结核病有较好的敏感性和特异性,是结核病诊断和鉴别诊断的可靠手段。

筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究

目的建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10的高亲和性适体。方法体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX技术筛选获得CFP-10的适体库。将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linkedoligonucleotide sorbent assay,ELOSA)测定亲和力。结果构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础。结论成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体。

结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺机制研究进展

吡嗪酰胺是治疗结核病最有效的一线药物之一。近年来,耐药结核菌引发的感染率呈上升趋势使得结核分枝杆菌耐药机制的研究成为热点,至今吡嗪酰胺确切的作用机制及结核分枝杆菌对其耐药机制尚未阐明。本文就结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药机制相关研究进展作一综述。

结核分枝杆菌CE抗原复合物对人单核-巨噬细胞TNF-α产生的影响

目的研究结核分枝杆菌早期分泌抗原CFP-10-ESAT-6复合物（CE复合物）对人单核-巨噬细胞TNF-α产生的影响。方法采用ELISA法检测大肠杆菌克隆表达纯化的CE复合物对不同分化阶段人单核-巨噬细胞TNF-α产生,以及对LPS刺激的反应。结果结核分枝杆菌CE复合物诱导人单核细胞释放TNF-α,在6-8h达高峰,48h后降至基础水平。CE在细胞分化早期短期预处理（〈72 h）对成熟巨噬细胞LPS刺激下TNF-α产生无明显影响,但CE早期（d1）开始持续处理（≥72 h）对分化7d巨噬细胞LPS刺激下的TNF-α产生有明显抑制作用,分化晚期（d5）处理对LPS刺激下巨噬细胞TNF-α的产生抑制作用不明显。结论CE复合物诱导人单核细胞的活化,并抑制成熟巨噬细胞炎性刺激下的活化作用,可能与结核菌免疫逃避和病理损害有关。

SEPTIC技术快速检测结核分枝杆菌

目的评价SEPTIC（sensing of phage—triggered ion cascade）技术在结核分枝杆菌快速检测中的应用价值。方法制备纳米阱微芯片，用于检测噬菌体感染细菌时导致细胞内离子释放发生的微范围内的电位变化。调整大肠杆菌、结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌及其相应噬菌体的浓度。将细菌和噬菌体等体积混合，37℃孵育1min。取5μl混合液滴于探针上，30S后开始采集数据，每2min采集一个数据文件，共采集10min，计算机分析采集结果。结果当结核分枝杆菌与分枝杆菌噬菌体D29混合反应时，在0—8min内显示了非常明确的1／f功率谱特征。而且功率谱强度明显高于阴性反应的功率谱，并出现了明确的电压超出±4盯范围的波形，持续约0．2S的时间，可认为发生了一次细菌被噬菌体感染的事件，表明探针明确地捕获了细菌被噬菌体感染的事件。结论SEPTIC技术能在较短时间内检测、鉴定出活菌的存在，有可能为结核分枝杆菌的检测提供一种简便、快捷的方法。

液体培养基比色法快速检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性

目的探讨液体培养基比色法在结核分枝杆菌（MTB）氧氟沙星（OFLX）耐药性快速测定中的应用价值。方法（1）材料：液体培养基为本室自制；氨基苯磺酰胺、N-（1-萘）乙烯二胺盐酸盐购于Sigma公司；NaNO3、盐酸购于上海化学试剂公司；OFLX购自sigma公司；

牛分枝杆菌的噬菌体快速检测方法研究

建立牛分枝杆菌噬菌体快速检测技术，探讨最佳的检测条件，并将建立的方法用于牛分枝杆菌及16种常见非结核分枝杆菌和6种其他细菌的检测。结果表明，噬菌体工作浓度为1×10^8PFU／ml、37℃感染2h为最佳检测条件。杀毒剂浓度在100mmol／L，室温作用10min即可完全杀灭受试噬菌体。选择浓度为4mg／ml的对数生长期指示细菌为工作浓度，获得理想的检测结果。加热灭活的细菌和指示细菌不被噬菌体感染。牛分枝杆菌和耻垢分枝杆菌检测结果为阳性，16种常见非结核分枝杆菌和6种其他细菌检测结果均为阴性。该法可检测出60～120条／ml牛分枝杆菌。重复性试验表明，批内、批间变异系数均小于15％．重复性良好。

结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的筛选与亲和性分析

目的通过建立指数级富集配体的系统进化技术(SELEX),筛选结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的方法,获得ESAT-6的高亲和性适体,为结核病诊断和治疗试剂的开发奠定基础。方法体外构建一个长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,SELEX技术筛选获得ESAT-6的适体库,将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,找出高亲和性适体。结果经过13轮筛选,ssDNA文库与ESAT-6亲和力从0.257提高到1.163,且12轮后A值趋于平衡,克隆、测序获得ESAT-6的高亲和性适体,其中适体A10亲和力最高,达到1.515,且与CFP10-ESAT6融合蛋白无交叉反应。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与ESAT-6结合的结构基础。结论成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了ESAT-6的高亲和性适体。

结核分枝杆菌Rv3872基因的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌Rv3872蛋白。方法聚合酶链反应(PCR)技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组中扩增出的表达Rv3872基因序列,将其克隆到pMD18-T载体后,测序分析。亚克隆该目的基因到pET28a表达载体,最终转化至大肠杆菌BL21(DE3),获得正确的阳性克隆子后大量表达重组Rv3872蛋白,再经纯化、定量后,通过Westernblot分析其抗原性。结果扩增Rv3872基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致,表达蛋白经SDS-PAGE分析,在约15000kD处有表达条带,纯化后的重组蛋白占总蛋白的90%以上。免疫印迹分析显示重组的Rv3872蛋白具有抗原性。结论成功表达结核分枝杆菌的Rv3872蛋白,为结核病血清学诊断候选抗原筛选和开发应用打下基础。

三种方法检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的比较

目的探讨绝对浓度法、液体培养基最低抑菌浓度(MIC)法和噬菌体生物扩增(PhaB)法检测结核分枝杆菌(MTB)吡嗪酰胺(PZA)耐药性的临床应用价值。方法应用3种方法同时检测90株MTB临床分离株PZA耐药性,并比较检测结果的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度。结果90株MTB临床分离株用绝对浓度法、液体培养基MIC法和PhaB法3种方法分别测得21株、33株、22株敏感株和69株、57株、68株耐药株。若以绝对浓度法测定结果为判断标准,则PhaB法检测PZA耐药性的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度分别为94.2%、85.7%、95.6%、81.8%、92.2%;若以液体培养基MIC法测定结果为判断标准,则PhaB法检测的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度分别为98.2%、63.6%、82.4%、95.5%、85.6%;若以绝对浓度法和液体培养基MIC法测定结果为判断标准,则PhaB法检测的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值及准确度分别为96.4%、90.0%、96.4%、90.0%、94.7%。结论绝对浓度法尽管是目前国内常用的方法,但影响因素较多;液体培养基MIC法测定虽能提早报告药物敏感结果,但检测条件尚需优化;PhaB法检测快速、简便、安全,有一定的应用价值。

结核分枝杆菌北京基因型菌株新型分子遗传标志的鉴定

目的分析结核分枝杆菌北京基因型菌株与非北京基因型菌株间差异表达的蛋白质,寻找可用于快速区分北京基因型的分型标志。方法应用间隔寡核苷酸分型法对56株结核分枝杆菌进行基因分型,经双向电泳技术比较北京基因型菌株与非北京基因型菌株的全菌蛋白表达图谱差异,差异表达的蛋白质通过基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱仪进行质谱分析,蛋白质数据库进行检索。进而对差异表达的蛋白质相应基因及上游进行序列分析。结果56株结核分枝杆菌中有49株为北京型菌株,7株为非北京型菌株。两个基因型菌株中差异明显表达的蛋白质为Rv0927c,该蛋白质斑点在49株北京基因型菌株中均缺失,而在7株非北京菌株和H37Rv中均有出现。北京基因型菌株Rv0927c基因有两个特征性突变:在421位核苷酸位点的AGC 3个碱基缺失,以及该基因上游127位点G→A的突变;而非北京基因型菌株该基因及其上游序列与H37Rv完全相同。结论Rv0927c基因在北京基因型菌株中的特征性突变,对开发新型区分北京基因型和非北京基因型结核分枝杆菌的方法奠定了基础。