mNGS在检验与临床中的应用

宏基因组二代测序(mNGS)投入临床使用的时间并不算长,但近些年随着诊断分子微生物学的飞速发展,mNGS因具有耗时短、检测范围广等优势受到检验科和临床的广泛关注。相较于传统的临床微生物的检测方法,mNGS不仅有效提高了病原微生物的检出率,也弥补了传统检测方法的不足,特别是在某些疑难重症感染性疾病的精准诊疗中发挥着重要作用。随着近年来mNGS相关应用规范及专家共识的相继出台[1-5],如何利用现有的新兴检测手段完善目前的临床诊疗路径,提高对疾病的诊断效率,是检验科和临床都亟待思考的问题。比如mNGS检测的基本流程和管理要求有哪些?mNGS在鉴别菌种方面的准确性如何?mNGS技术应用于感染性疾病的临床适应证有哪些?mNGS报告如何解读,解读应注意哪些问题?在什么场景或时机下使用mNGS可以最大化提高患者的预后?医院检验科可以依托mNGS平台开展哪些临床研究工作?检验科和临床对mNGS未来发展的期待是什么?

检验与临床沟通及融合发展路在何方?

“以患者和临床为中心”是检验医学的核心理念。在此次新型冠状病毒肺炎疫情中,检验人奋战在抗疫一线,在筛查感染病例、解读检测报告、沟通临床与疾病预防控制等方面发挥了重大作用,诠释了使命与担当。透过疫情,回归到常规临床工作中,检验与临床沟通依然存在或多或少的隔阂,与“以患者和临床为中心”的理念渐行渐远。随着AI时代的来临,在信息化、自动化、智能化流水线的打造下,检测效率和质量得到了极大提高,随之而来的是人的作用是否被弱化或检验医师可能逐渐被机器所取代。如何应对AI浪潮的冲击,实现检验人自身价值的提升,是不得不认真思考和严肃面对的问题。

重症监护病房下呼吸道感染病原菌分布和耐药性分析

目的分析2007—2009年重症监护病房(intensive care unit,ICU)下呼吸道感染病原茵分布和耐药性,为医院感染控制和临床合理应用抗茵药物提供依据。方法对分离培养出的266株感染病原茵,采用MIC法进行药敏试验,使用WHONET 5.4软件进行分析。结果下呼吸道感染病原菌主要为G-杆茵,占66.54%,常见为:鲍曼不动杆菌(30.83%)、铜绿假单胞菌(13.53%)、肺炎克雷伯菌(8.65%);G+球菌占16.92%,以金黄色葡萄球菌为主(11.65%);真菌感染占16.54%。非发酵G-菌对包括亚胺培南在内的绝大多数抗菌药物耐药;耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌检出率高达80%以上。结论 ICU非发酵G-茵和金黄色葡萄球菌耐药性严重,有增加趋势。应重视合理应用抗菌药物,并采取措施防止医源性交叉感染。

基于可变数目串联重复序列的痰液结核分枝杆菌检测方法建立及初步应用

目的：结核分枝杆菌散在分布重复单位及可变数目串联重复序列（ MIRU-VNTR）是一项应用于结核分枝杆菌分子分型的技术，本研究基于该技术旨在建立一种直接应用临床痰液标本检测结核分枝杆菌的实验室方法。方法：根据扩增条件及临床检测的实际需要，优化选择八个 MIRU-VNTR 位点（ MTUB21、MTUB04、QUB18、QUB26、QUB11b、MIRU31、MIRU10和MIRU26）作为检测靶标，收集130例肺结核患者和200例非肺结核患者（其他肺部疾病）的痰液样本，分别以传统的罗氏培养法和临床诊断的方法为标准，用MIRU-VNTR分析和荧光定量聚合酶链反应（ FQ-PCR ）对上述样本进行检测。结果：以罗氏培养法为标准时， MIRU-VNTR 的灵敏度为93.1％，特异度为97.7％；FQ-PCR 检测的灵敏度为94.0％，特异度为96.7％，MIRU-VNTR分析与FQ-PCR检测结果准确度差异无统计学意义（χ2＝0.352， P＝0.569）。以临床诊断为标准时， MIRU-VNTR分析的灵敏度为86.9％，特异度为100％；FQ-PCR 检测的灵敏度为87.7％，特异度为99.0％，两种方法检测结果准确度差异无统计学意义（χ2＝0.030， P＝0.862），且MIRU-VNTR分析中未发现假阳性结果。在MIRU-VNTR检测为阳性的结果中，98.2％（111／113）的样本分子编码互不相同，只有1.8％（2／113）分子编码一致（皆为54685538）。结论：应用临床痰液标本建立的基于MIRU-VNTR的结核分枝杆菌快速检测方法有着较好的应用价值。

NSCLC患者血清HDAC1和DNMT1含量对临床病理分期、恶性分子表达的评估价值

目的：研究非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）患者血清组蛋白去乙酰化酶1（histonedeacetylases1，HDAC1）和DNA甲基化转移酶1（DNAmethyltransferase1，DNMTl）含量与肿瘤临床病理分期、恶性分子表达的相关性。方法：选择2012年4月～2015年10月在我院确诊为NSCLC的89例患者作为恶性组，并收集血清样本、肺癌组织，64例肺部良性病变患者作为良性组并收集血清标本，测定血清中HDAC1、DNMT1含量以及肺癌组织中p53、p21、PTEN、C-myc、MKi-67的表达量。结果：恶性组血清中DNMT1和HDAC1的含量显著高于对照组（P〈0．05），且TNM分期越高、血清中DNMT1和HDAC1的含量越高，而不同组织类型NSCLC患者血清中DNMT1和HDAC1的含量无显著性差异（P〉0．05）；恶性组TNM分期越高，肿瘤组织中p21、p53、PTEN的表达量越低，且与血清DNMT1、HDAC1含量呈负相关，C-myc、MKi-67的表达量越高且与血清DNMT1、HDAC1含量呈正相关。结论：NSCLC血清中DNMT1和HDAC1的含量显著升高并且能够降低抑癌基因表达、促进原癌基因表达并参与肿瘤的发生发展。

运用线性探针技术快速检测耐多糖结核分枝杆菌的效果评价

目的评估线性探针技术快速检测耐多药结核分枝杆菌的效果。方法选取317例结核分枝杆菌分离株分别进行MGIT960液体药物敏感性试验和线性探针快速检测,以液体法作为金标准,探讨线性探针检测技术的敏感性和特异性以及Kappa值。结果 317株结核分枝杆菌复合群样本分别进行MGIT960液体药物敏感性试验和线性探针快速检测,其中液体法利福平(RFP)耐药率为5.5%,异烟肼耐药率为11.5%,耐多药(MDR)患者检出率为4.7%;线性探针快速检测法利福平(RFP)耐药率为7.4%,异烟肼耐药率为11.7%,MDR检出率为5.7%。以液体法为金标准,线性探针检测技术检测利福平和异烟肼的敏感性和特异性分别为94.3%、97.7%和86.3%、98.0%。结论线性探针检测技术是一个敏感、特异和快速的诊断M DR的有效方法。

GeneXpert Mtb/RIF检测技术在临床耐药结核病诊断中的应用价值

目的评估GeneXpert Mtb/RIF检测技术在临床耐药结核病诊断中的应用效果。方法收取240例结核病住院患者的晨痰样本分别进行痰涂片镜检、MGIT960液体培养及GeneXpert Mtb/RIF快速检测,对于MGIT960液体培养与GeneXpert同为阳性的样本进一步进行MGIT960药敏检测。以MGIT960液体法作为金标准,评估GeneXpert Mtb/RIF检测技术的敏感性和特异性以及Kappa值。结果 224例有效样本中涂片镜检阳性检测率为26.8%,MGIT960液体培养阳性检出率为45.1%,GeneXpert检测阳性检出率为46.9%;以MGIT960液体培养作为金标准,涂片镜检法的敏感度为59.4%,特异度为75.0%,GeneXpert检测法敏感度为91.1%,特异度为92.4%;以MGIT960药敏检测为金标准,GeneXpert检测法与之相比两种方法的一致性为96.7%,敏感度为92.3%,特异度为98.5%。结论 GeneXpert Mtb/RIF检测技术是一个敏感、特异和快速有效方法,有利于结核病的早期诊断。

T-Spot试验在结核病诊断中的价值

目的评价T-Spot检测在结核病诊断中的作用。方法回顾性分析2016年1月1日至2016年9月30日在同济大学附属肺科医院同批次进行T-Spot、痰液结核菌培养、痰结核菌荧光染色涂片、痰TB-SAT和结合抗体检测的患者479例,计算T-Spot试验在结核病诊断中的灵敏度、特异度、阴阳性预测值,评价T-Spot检测在在结核病诊断中的作用。结果 T-Spot检测的灵敏度为96.47%(355/368),特异度为78.38%(87/111),阳性预测值93.67%(355/379),阴性预测值为87%(87/100)。T-Spot在肺结核和肺外结核中的敏感性分别为96.77%(270/279)和95.5%(85/89),特异性为78.38%(87/111),两者差异无统计学意义(P>0.05)。T-Spot试验灵敏度高于痰液结核菌培养、痰结核菌荧光染色涂片、痰TB-SAT和结合抗体检测,差异有统计学意义(P<0.05)。外周血TSpot检测联合TB-Ab检测敏感性为98.10%(361/368),对比T-Spot单项检测差异有统计学意义(P<0.05)。菌阴性结核患者T-Spot检测敏感性为95.48%(148/155),特异性为92.47%(86/93),肺结核与肺外结核患者差异无统计学意义。结论 T-Spot检测可辅助临床诊断或排除结核,T-Spot检测联合血清结合抗体检测可提高结核患者检出率,T-Spot检测有助于菌阴性结核患者的诊断。

电泳新进展及其在微生物研究中的应用

电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶等）中，于电场的作用下，按各自速度向其对应的电极方向泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。电泳法可分为自由电泳及区带电泳两大类。

心肺运动试验参数的性别差异对特发性肺动脉高压患者无事件生存率的影响

目的研究特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH)患者性别特异的心肺运动试验(cardiopulmonary exercise testing,CP_(ET))参数对无事件生存率的影响。方法回顾性纳入2010年5月至2016年4月同济大学附属肺科院肺循环科初次住院的IPAH患者,共56例(男性21例,女性35例),按照有无恶化事件发生进行亚组分析。所有患者均进行了右心导管检查及CP_(ET)。多因素Cox比例风险分析预测发生临床恶化事件的独立预测因素,受试者工作特征曲线确定各独立预测因素的阈值。结果男性及女性IPAH患者的一般临床资料及血流动力学指标差异无统计学意义。与女性患者相比,男性患者具有较高的peak VE,P_(ET)O_2at AT,peak P_(ET)O_2以及较低的peak VO_2/VE及P_(ET)CO_2at AT。亚组分析中,男性event组的peak workload显著低于无事件组;而peak O_2pulse则在女性患者event组中降低。此外,event组男性相较于女性显示出较高的peak VE,Nadir VE/VCO_2,P_(ET)O_2at AT和peak P_(ET)O_2,而peak VO_2/VE,P_(ET)CO_2at AT和peak P_(ET)CO_2则降低。peak P_(ET)CO_2和peak O_2pulse分别是预测男性和女性IPAH患者无事件生存率的独立预后因素。结论 CP_(ET)参数中用于预测IPAH患者无事件生存率的独立预测因素体现出显著的性别差异,或许可以用不同CP_(ET)参数进一步研究IPAH患者在发病机制、个体化治疗及预测临床结局上的价值。

实体瘤浸润B淋巴细胞的研究进展

迄今为止的免疫疗法研究主要集中于T淋巴细胞,但越来越多的证据表明,肿瘤浸润B淋巴细胞和浆细胞[统称为肿瘤浸润B淋巴细胞(tumor-infiltrating B lymphocyte,TIL-B)]在肿瘤控制中具有至关重要的协同作用。在许多癌症中,TIL-B在标准治疗和免疫检查点阻断的背景下均显示出较高的预测和预后意义,为利用其独特的免疫学特性提供了新的治疗机会的前景。本文旨在综述实体瘤浸润B淋巴细胞的研究进展。

基于全基因组测序的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及分子特征研究

目的明确本地区碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药特点和分子流行病学特征,为临床抗感染治疗提供依据。方法收集宁波大学附属第一医院和宁波市第二医院碳青霉烯类不敏感肺炎克雷伯菌92株。用VITEK2 Compact全自动微生物分析仪进行药敏试验;全基因组测序技术确定其荚膜血清型、多位点序列分型(MLST)与耐药基因等分子特征;使用PlasmidFinder确定菌株的质粒复制子类型;Parsnp进行细菌核心基因组系统发育分析。结果CRKP主要分离自病情较为危重的老年患者,标本以痰液居多(51.09%,47/92),其次是尿液(13.04%,12/92)和血液(8.70%,8/92),感染高发科室为重症监护病房(33.70%,31/92)。所有菌株对常用抗菌药物耐药率高,但对多黏菌素B耐药率较低(6.52%,6/92)。耐药基因以bla_(KPC-2)为主(78.26%,72/92),荚膜血清型以KL64为主(48.91%,45/92),MLST分型以ST11为主(54.35%,50/92)。ST11-KL64是优势克隆型,检出率高达46.74%(43/92),且携带多个质粒,以IncR和IncFⅡ型为主。结论本地区CRKP对临床常用抗菌药物高度耐药,主要携带bla_(KPC-2)耐药基因,克隆型ST11-KL64在本地区广泛克隆传播,两家医院流行的菌株存在相似性,应加强监控。

恒温扩增实时荧光检测技术在肺结核诊断中的临床价值

目的评估RNA恒温扩增实时荧光检测技术（SAT）在临床痰液标本结核分枝杆菌检测中的价值。方法对2011年9至12月上海市肺科医院230例临床确诊肺结核患者和78例其他呼吸系统疾病患者的痰液分别用SAT法、BD960培养法、罗氏培养法和集菌涂片法同时进行检测。SAT法与BD960培养法结果不符标本，再用结核分枝杆菌核酸扩增荧光体外检测试剂盒（PCR—TB）进行检测，同时对BD960培养阳性菌株和SAT扩增产物进行扩增及测序，对菌种进行鉴定。采用，检验比较SAT法与上述3种方法对结核病患者的阳性检出率。结果以BD960培养法作为金标准（剔除BD960培养法中有7份污染菌），则SAT方法的敏感度为90．5％（95／105），特异度为84．2％（165／196），阳性预测值为75．4％（95／126），阴性预测值为94．3％（165／175）。SAT法与BD960培养法结果符合率为86．4％（260／301）。223份临床确诊的肺结核患者痰标本SAT法、BD960培养法、罗氏培养法和涂片法的阳性检出率分别为56．5％（126／223）、45．7％（102／223）、41．7％（93／223）和37．2％（83／223），SAT法显著高于其他3种方法，差异有统计学意义（X2=4．087，P〈0．05）。结论SAT技术用于结核分枝杆菌实验室诊断具有特异度高、敏感度好，操作简便、快速，污染率低的特点，有望成为实验室诊断的新方法。