丙戊酸钠抑制肺癌细胞株A549增殖的研究

目的研究丙戊酸钠（sodium valproate,VPA）对肺癌细胞株A549细胞增殖的影响。方法体外不同浓度VPA不同作用时间处理人肺癌细胞株A549,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞技术分析细胞周期与细胞凋亡的改变。结果2.0 mmol/L VPA作用72 h细胞形态明显改变、细胞数明显减少。1.0mmol/L VPA作用72 h后,细胞增殖被抑制,抑制率为（15.8±2.8）%,与同期对照组相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）;提高处理浓度或延长作用时间,抑制作用有加强趋势。1.0 mmol/L VPA作用72 h后可改变细胞周期分布,G1期细胞比例为（72.2±3.4）%,与同期对照组相比差异显著;2.0 mmol/LVPA处理24～72 h后G1细胞比例由（64.5±3.7）%增加至（79.8±4.4）%,而S期细胞由（30.7±5.17）%降低至（14.2±3.37）%;提高处理浓度或延长作用时间均使G1期细胞比例增高,S期细胞比例减少。2 mmol/L VPA作用24～72 h可提高细胞凋亡率,由（7.30±1.87）%增加到（19.85±2.40）%。结论VPA可抑制肺癌A549细胞生长,改变细胞周期分布、促进细胞凋亡。

重组EGFR-γFc融合DNA疫苗联合热疗抗肿瘤免疫的实验研究

目的构建EGFR-γFc融合DNA疫苗并观察其联合41℃热疗对小鼠移植肿瘤的抑制作用。方法以异种同源鸡EGFR膜外部分与IgG的γFc段的基因片段为基础构建真核表达质粒PVAX1/cEGFR-γFc,免疫荧光法检测融合蛋白在真核细胞中的表达,随后将Lew is肺癌移植瘤小鼠随机分为疫苗组、热疗组、合并组和对照组。疫苗组于每只小鼠双侧股四头肌注射100μg重组质粒,每5 d重复1次,共3次;热疗组对荷瘤小鼠行局部41℃热疗,每5 d重复1次,共3次;联合组小鼠按疫苗组小鼠的同样方法注射质粒后同时行局部热疗;对照组小鼠注射生理盐水。末次处理5 d后ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞上清液中细胞因子IL-2和IFN-γ的水平,流式细胞仪测定脾细胞淋巴细胞亚群;观察小鼠荷瘤后的生存率;末次处理后14 d部分成瘤动物处死,取出瘤体称重,计算抑瘤率。结果联合组小鼠脾淋巴细胞TH1型细胞因子IL-2和IFN-γ浓度较其他各组明显升高(P<0.01),CD8+T淋巴细胞数目增加(P<0.01),接瘤后14 d联合组平均瘤重低于其他各组(P<0.01),抑瘤率达70%,接瘤后30 d联合组动物生存率也高于其他各组。结论41℃热疗可能通过细胞免疫增强EGFR靶向DNA疫苗的抗肿瘤效果,热疗联合EGFR靶向DNA疫苗可能是一种有希望的抗肿瘤途径。

蛋白激酶C抑制剂对人非小细胞肺癌细胞株药物敏感性的影响

背景与目的蛋白激酶C(PKC)在癌变过程中的作用使其成为肿瘤治疗的潜在重要靶点。非小细胞肺癌(NSCLC)中存在PKC-α的异常表达和活性增高,PKC抑制剂能通过诱导肿瘤细胞凋亡、增强细胞毒作用及下调多药耐药基因的表达而发挥其抗肿瘤作用。通过观察PKC抑制剂白屈菜红碱(CH)对四种人NSCLC细胞株药物敏感性的影响,初步探讨其作用机制。方法以PKC抑制剂CH分别处理四种NSCLC细胞株H1299、H460、A549及耐顺铂A549细胞株,逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)及蛋白印迹法(Westernblot)检测PKC-α的mRNA及蛋白表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞株对顺铂药物敏感性。结果用药前A549/DDP细胞株中PKC-αmRNA及蛋白的表达水平高于NSCLC细胞株H1299、H460及亲本A549细胞株(P<0.05),CH处理后四种NSCLC细胞株中PKC-αmRNA及蛋白的表达水平均有不同程度的下降,CH处理4h及24h后H1299、H460、A549细胞株的凋亡率无明显增加,仅A549/DDP细胞株的凋亡率明显增加,用药后NSCLC细胞株对顺铂的药物敏感性即IC50值有不同程度的下降,以A549/DDP细胞株降低更为明显(P<0.05)。结论四种NSCLC细胞株中存在PKC-αmRNA及蛋白的高表达。通过抑制NSCLC细胞株中PKC-αmRNA及蛋白的表达,PKC抑制剂CH能增加其对顺铂的药物敏感性。与亲本A549细胞株相比,PKC抑制剂CH能通过抑制耐顺铂A549细胞株中PKC-α蛋白的表达及增加细胞凋亡率,而更有效地增加其对顺铂的药物敏感性。

异种EGFR口服DNA疫苗抑制小鼠Lewis肺癌的生长

目的:观察表达异种鸡EGFR(chicren EGFR,cEGFR)与IgGγFc融合基因的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗对高表达EGFR的肺癌Lewis细胞小鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:将pVAX1-cEGFR-γFc质粒转化减毒沙门菌SL7207,重组菌SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,免疫荧光法检测cEGFR-γFc融合蛋白的表达。SL7207/pVAX1-cEG-FR-γFc重组菌口服免疫小鼠3次后接种Lewis细胞,Western blotting检测小鼠体内融合蛋白的表达,ELISA法检测免疫小鼠血清抗EGFR抗体的水平。接种Lewis细胞14 d后处死小鼠,瘤体称质量,检测SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc疫苗对Lewis肺癌生长的抑制作用,测定荷瘤小鼠的生存时间。结果:成功构建减毒沙门菌疫苗SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc,SL7207/pVAX1-cEG-FR-γFc感染后,在小鼠后体内外都能检测到cEGFR-γFc融合蛋白的表达;SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc疫苗口服免疫后小鼠能够产生高水平的抗EGFR抗体,口服SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc疫苗能够有效抑制小鼠Lewis移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。结论:异种EGFR口服DNA疫苗能够有效地抑制高表达EGFR肺癌的生长,是EGFR分子靶向治疗的一条新途径。

非离子表面活性剂对肿瘤细胞多药耐药性逆转的实验研究

目的探讨非离子表面活性剂聚氧乙烯醚聚乙二醇300曲拉通X100对肺癌耐药细胞A549/DDP(顺铂)多药耐药性的逆转及其机制。方法用MTT法进行体外耐药逆转实验,荧光分光光度计测定细胞内ADM药物浓度。结果合用非离子型表面活性剂前后,A549／DDP对化疗药物阿霉素、顺铂、丝裂霉素、5-FU、依托泊甙和长春新碱的敏感性均有显著性差异(各组都为P<0．01);三种非离子型表面活性剂都能显著增加耐药细胞内ADM浓度,实验组与对照组比较差异有显著性(P<0．01)。结论三种非离子表面活性剂具有逆转A549/DDP耐药性的作用,逆转机制可能是改变细胞膜的流动性,抑制多药耐药相关膜蛋白的功能。

VEGF DNA疫苗注射部位对小鼠抗原表达与Th细胞活性的影响

目的探讨小鼠不同部位皮下注射VEGF DNA疫苗对抗原表达与Th细胞活性的影响,为DNA疫苗在体内获得良好的细胞免疫提供优化条件。方法用RT-PCR法从A459细胞株中扩增570 bp的VEGF片段,此片段构建成真核表达重组质粒pVAX1-VEGF;在小鼠耳廓、胸部、腹部及背部皮下注射1μg/μl的pVAX1-VEGF DNA100μl,ELISA法检测血清中VEGF抗原表达水平和脾细胞产生的IL-4及IFN-γ动态变化。结果小鼠耳廓、胸部及腹部免疫,VEGF抗原表达较强,其中耳廓免疫所激活的Th1细胞最强,产生524.2 pg/ml IFN-γ,与胸部、腹部及背部免疫的效果相比,差异显著;pVAX1-VEGF疫苗组与pVAX1对照组的Th1与Th2细胞活性差异均显著,不同部位的pVAX1-VEGF疫苗组对Th2细胞活性无明显影响。结论本研究所构建人源VEGF的DNA疫苗能在小鼠体内有效表达,且不同部位皮下免疫后均可激活Th细胞,但以Th1细胞效应为主和耳廓皮下接种最佳。