CUT&Tag产物回收和建库方法的优化

新兴的染色质靶向切割和标签化(clevage under target and tagment,CUT&Tag)技术利用转座酶在目标蛋白结合的DNA附近进行切割并对切割下的DNA片段进行标签化,通过后续的二代测序可以快速鉴定蛋白质-DNA相互作用,极大的简化了染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)的实验过程。CUT&Tag中转座酶完成标签化后需要DNA回收或其他后处理才能进行建库PCR,不同的回收方法对CUT&Tag结果有着显著的影响。通过建立生物素化转座体-链霉亲和素磁珠体系(streptavidin beads recovery CUT&Tag,srCUT&Tag),可以快速便捷地完成CUT&Tag的产物回收。本文在K562细胞中展开H3K4me3、RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ)、转录因子CTCF和HMGA1的CUT&Tag实验,并利用现有的乙醇沉淀、片段分选(solid-phase reversible immobilization,SPRI)磁珠回收和直接PCR法,以及本研究建立的srCUT&Tag方法对产物进行回收。结果表明,从整体上看,SPRI磁珠回收和srCUT&Tag方法着较高的回收效率,而乙醇沉淀法则回收效率低下。在全部4种CUT&Tag产物回收过程中,SPRI磁珠回收均会损失大部分小于150 bp的产物片段。在CTCF和HMGA1 CUT&Tag产物的回收中,直接PCR法则损失了大部分大于300 bp的片段并与其他回收方法的结果有较大的差别。因此,srCUT&Tag能够比其他三种回收方法提供更多更完整的测序信息。综上所述,新建立srCUT&Tag回收方法相比现有的CUT&Tag产物回收方法能提高建库效率并得到更好的数据质量,为表观遗传学研究提供了更好的技术选择。

重组右旋糖酐酶的表达、纯化及性质研究

将Lipomycesstarkeyi CGMCC 2.1390菌株的DEX基因进行PCR扩增并克隆至表达载体pPICZαA上,将重组质粒转化至Pichia pastoris X33细胞中进行甲醇诱导分泌表达。质粒转化至Pichia pastoris X33细胞中,经1%甲醇诱导72h表达重组蛋白,培养基上清中DEX浓度和酶活力分别为14.3mg/L、25648U/L。重组蛋白经过两步层析纯化后,纯度为90%,酶活力回收率为58.4%,比活力为7130U/mg。重组DEX最适反应温度为35℃,最适反应p H值为5.0,酶在低于40℃、p H3.0～8.0稳定。以右旋糖酐20k Da为底物,酶的Km值为6.2×10^(-4)mol/L,Vmax值为4.0×10^(-3)mol/min·L;以右旋糖酐70kDa为底物,酶的K_m=7.4×10^(-5)mol/L,V_(max)=3.0×10^(-3)mol/min·L。Zn^(2+)对酶活力有微弱促进作用,Ca^(2+)对酶活力有轻微抑制。10%Sucrose有利于提高重组DEX的保存稳定性。

循环酶法同型半胱氨酸检测关键酶CBS和CBL的开发及试剂盒研制初探

以酿酒酵母基因组为模板通过PCR分别扩增胱硫醚β合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)和胱硫醚β-裂解酶(cystathionine β-lyase,CBL)目的基因片段,经无缝克隆构建表达质粒并转化大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)。经诱导表达和纯化后,重组蛋白的纯度均达到90%,回收率均达到80%,可溶表达量分别为26 mg/L和332 mg/L。经催化活性测定,CBS的单位酶活为15 U/mg,CBL的单位酶活为72 U/mg。在此基础上初步开发了循环酶法同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)检测试剂盒,实验结果证明该试剂盒的有效性和稳定性均符合体外诊断检测的要求,其检测性能与市售进口同类试剂盒基本一致。