氯霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立检测动物源性食品中氯霉素(CAP)残留的间接竞争ELISA(ci-ELISA)方法。在CAP羟基(-OH)位点上引入活性基团羧基(-COOH)得到氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS);采用混合酸酐法将CAP-HS分别与BSA和OVA偶联合成人工免疫原CAP-HS-BSA和包被抗原CAP-HS-OVA,用CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和ci-ELISA筛选细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备抗CAP单克隆抗体;以CAP单克隆抗体为基础、CAP-HS-OVA为检测原建立ci-ELISA方法。结果显示,试验成功筛选获得一株稳定分泌抗CAP抗体的杂交瘤细胞株(2C4),抗体效价为4.8×10-5,利用2C4腹水优化得到ci-ELISA最佳试验条件:0.4μg/mL CAPHS-OVA 37℃包被2h;5%猪血清37℃封闭1h;1∶6.4×104 CAP单克隆抗体37℃孵育15min;1∶1 000羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)37℃孵育30min;室温显色9min。绘制的CAP残留ci-ELISA标准曲线为典型的S型,与4参数logit拟合曲线相吻合,半数抑制浓度(IC50)为0.53ng/mL。添加回收试验结果显示,阴性鱼肉、牛奶的回收率分别为93.3%~96.6%和93.7%~96.8%,批内变异系数分别为2.3%~5.0%和2.2%~4.6%,批间变异系数分别为2.7%~4.1%和2.3%~3.6%。HPLC对比试验结果显示,ci-ELISA与HPLC的测定结果无显著差异。本试验成功建立了CAP的ELISA残留检测方法,该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度,可满足动物源性食品中CAP残留检测要求。

动物源性食品中氯霉素残留免疫分析技术研究进展

氯霉素(CAP)作为一种动物性食品中国际禁用的抗菌素,其残留物不仅会通过进入食物链而危害人类健康,而且还会引起耐药菌的传播,因此,开发对其残留的检测技术尤为重要。本文综述了近10年来常用的检测动物源性食品中CAP残留的技术,重点介绍了免疫分析法(ELISA、侧流免疫分析法)和核酸适配体技术,并对当前和今后该技术的发展情况进行了客观分析。

金刚烷胺单克隆抗体的制备和鉴定

为制备金刚烷胺(AMD)的单克隆抗体(mAb),改造AMD的半抗原,采用EDC/NHS法合成人工免疫原AMD-BSA和检测抗原AMD-OVA,经紫外扫描和凝胶电泳进行鉴定,AMD与载体蛋白[牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)]成功偶联;用被免疫原(AMD-BSA)免疫BALBC/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,获得AMD杂交瘤细胞株,腹腔注射小鼠后,得到抗AMD的mAb。小鼠免疫后的多抗血清的效价均在6.4×10^3以上,所制得的杂交瘤细胞上清液的效价为3.6×10^2~1.0×10^3,2D5细胞株的腹水效价为5.12×10^5,对AMD的IC50值为1.02μg/L,除与金刚乙胺的交叉反应率为9.82%,与其他结构类似物无交叉反应性。表明获得了高价、敏感和特异的抗AMD的单克隆抗体,为进一步的免疫学快速检测提供了技术支持。

间接竞争ELISA检测蜂蜜中氧氟沙星残留

为了建立间接竞争ELISA法检测氧氟沙星(Ofloxacin,OFLX)在蜂蜜中的残留,本研究采用活性酯法将OFLX与载体蛋白偶联,得到抗OFLX完全抗原(OFLX-BSA)和检测抗原(OFLX-OVA)。采用OFLX-BSA免疫BALB/c小鼠,之后用杂交瘤等技术制备抗OFLX单克隆抗体。通过优化反应条件,建立间接竞争ELISA方法,并对该法的准确度、精密度和特异性进行判定。结果显示OFLX与载体蛋白偶联成功;得到一株抗OFLX的杂交瘤细胞株(3D7),单克隆抗体的IC50值为1.17 ng/mL;该法在蜂蜜中的OFLX平均添加回收率为84.1%,其批间变异系数均大于批内的变异系数,与马波沙星的交叉反应率为52.9%,与其他竞争反应物没有交叉反应。本研究建立的间接竞争ELISA方法能够满足OFLX在蜂蜜中残留的测定需求。

己烷雌酚免疫原的合成及其鼠源抗血清的制备

目的合成己烷雌酚(hexestrol,HES)免疫原,并制备其鼠源多抗血清。方法在HES的适当位点上引入活性基团羧基(-COOH)得到HES的半抗原,采用EDC/NHS法合成人工免疫原HES-BSA和检测抗原HES-OVA,经紫外扫描和SDS-PAGE鉴定HES与载体蛋白BSA、OVA是否成功偶联;用免疫原(HES-BSA)免疫3只BALB/c小鼠,获得抗HES多抗血清(polyclonal antibody serum,pAbs),ELISA法检测其效价,间接竞争ELISA法检测其敏感性,交叉反应(cross-reactivity,CR)试验检测其特异性。结果免疫的1号小鼠pAbs效价达到1.28×10^4,2号和3号小鼠均在6.4×10^3以上;1号小鼠HES pAbs对HES的50%抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为19.93 ng/mL,除与己烯雌酚有11.63%的CR外,与其他结构类似物无CR。结论获得了效价高及敏感、特异的多抗血清,为进一步的免疫学快速检测提供了技术支持。