Designing Primers for H5 and H7 Subtypes of Avian Influenza Virus and Multiplex RT-PCR Amplification

[Objective] The research aimed to design primers that are suitable for detecting H5 and H7 subtypes of avian influenza virus （AIV） ; [Method] DNAStar was used to analyze the homology of the sequences of H5 and H7 subtypes of AIV accessed in GenBank, and design primers（ by Primer Premier 5.0） on high homologous region of these sequences, and then amplified by RT-PCR. [Result] The multiplex RT-PCR amplification, agarose gel electrophoresis and sequencing results showed that the self-designed primers are successful for detecting AIV. [Conclusion] It is feasible to rapidly diagnose AIV through this method.

禽流感病毒H5亚型及H7亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增

[目的]设计能用于多重RT-PCR扩增禽流感病毒H5、H7亚型基因的引物。[方法]在GenBank中搜索H5、H7亚型禽流感病毒的基因序列,并利用DNAStar分析其同源性,采用Primer Premier 5.0软件设计引物。[结果]多重RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及测序结果显示引物设计成功。[结论]该方法用于禽流感病毒的快速诊断是可行的。

禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增

PCR技术是分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。然而,找到一对合适的核苷酸片段作为引物,使其有效地扩增模板DNA序列,决定着PCR的成败。在GENEBANK中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析它们的同源性,利用Primer Premier5.0软件进行引物设计。多重RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳结果显示引物设计成功。

多重反转录聚合酶链式反应检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的研究

利用多重反转录聚合酶链式反应同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒.在GenBank中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析其相似性,利用Primer Premier 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物.这3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228和830 bp.结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228和830 bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV cDNA的最低检出量分别为10 pg、1 ng和10 pg.

鸡痘病毒表达载体的构建Ⅰ、鸡痘病毒282E_4株基因组PstⅠ、HindⅢ酶切片段的克隆及酶切分析

本文介绍了鸡痘病毒２８２Ｅ４株基团组ＰｓｔⅠ片段、ＨｉｎｄⅢ片段的克隆和鉴定，以及部分克隆的限制性内切酶分析。鸡痘病毒基因组经酶切、克隆分别得到３４９个、２７７个白色菌落，经质粒电泳、菌落杂交筛选分别得到２８６、２３４个重组菌落，再经酶切、斑卢、杂交鉴定，证明了所克隆的确为鸡痘病毒的ＰｓｔⅠ、ＨｉｎｄⅢ片段。最后经单、双酶切分析，得到了５个ｐＦＰ、５个ｐＦＨ克隆的物理图谱。

一种平末端连接的有效方法

转化效率与质粒大小成反比，而当质粒大于１５ｋｂ时，转化效率将成为限制因素，此时提高连接效率极为必要，特别是对于具有普遍性而效率又低的平末端连接。我们在连接反应体系中，加入相应的产生平末端质粒载体的限制性内切酶ＨＰａＩ、或ＥｃｏＲＶ，与不加ＨＰａＩ、或ＥｃｏＲＶ的连接反应相对照，连接产物转化大肠杆菌ＪＭ１０９后，产生的转化子比率分别为１９．９％和５．６％（ＰＦＰ７），３２．６％和９．７％（ｐＦＢ１７５），２４．３％和３．６％（ｐＦＨ１２），３７．９％和１０．３％（ｐＦＰ２６），且从转化株中分离的质＃ＤＮＡ经电泳、酶切鉴定为目的产物。ＨｐａＩ、或ＥｃｏＲＶ的存在极有利于插入片段连接到载体上，同时抑制载体自身环化或寡聚化，大大提高了平末端连接效率。

H5、H7和H9亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链式反应检测方法的建立

参考GenBank登录的H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,利用DNAStar软件分析其同源性,利用Primer Premier5.0软件设计3对分别针对AIVH5、H7和H9亚型的特异性引物。3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228、830bp。结果显示,利用3对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。该方法对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228、830bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对H5、H7和H9亚型AIVcDNA的最低检出量分别为10-4、10-2和10-4。结果表明,本试验建立了可同时检测鉴别H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。