蜜蜂KBV和APV病毒RT-PCR检测技术研究

根据蜜蜂克什米尔病毒(Kashmirbeevirus,KBV)和急性麻痹病毒(Acuteparalysisvirus,APV)的RNA聚合酶基因序列,参照DonStoltz报道的引物KBV1、KBV2,美国农业部提供的引物DC62F、DC682R,对美国农业部惠赠的标准KBV和APV的RNA聚合酶基因片段,以及2001-2002年收集到的中国21个省市的180份疑似KBV和APV病蜂RNA聚合酶基因片段进行RT-PCR。对以KBV1、KBV2和DC62F、DC682R为引物扩增出的RNA聚合酶基因片段进行克隆、转化,并对克隆结果测序,证明其可靠性。建立了用分子生物学方法检测蜜蜂KBV和APV病毒的技术,有一定的应用前景。检测结果表明:到目前为止,我国蜜蜂群中未发现KBV和APV病毒病。

犬Ⅱ型腺病毒弱毒DNA的酶切分析及分子克隆

犬Ⅱ型腺病毒(CAV-2)是犬喉气管炎的病原。CAV-2感染通常只引起轻微的呼吸道疾病,但在其它病毒或细菌继发感染下可诱发较严重的肺炎、支气管炎、扁桃体炎和咽炎。此病毒与引起传染性犬肝炎(ICH)的CAV-1有密切的抗原相关性。CAV-2弱毒株可产生抗CAV-1的保护性免疫,是目前用于预防ICH和狐狸脑炎的有效疫苗。由于CAV-2本身致病不严重,致弱的CAV-2更为安全。因此,用弱毒株构建成基因工程载体,把犬细小病毒或犬及狐狸的其它病毒的主要抗原基因重组到其中的非必需区,可获得安全、有效和多用的病毒载体疫苗。为此,我们首先分析了CAV-2弱毒DNA的酶切图谱,并克隆了全病毒DNA的76.5％。

犬Ⅰ型腺病毒DNA的酶切分析及分子克隆

犬Ⅰ型腺病毒(CAV-1)弱毒用限制性内切酶EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,Pst Ⅰ,Sph Ⅰ和Hind Ⅲ消化分析后其图谱与强毒株相比没有差异。将弱毒DNA用Pst Ⅰ完全消化后以鸟枪法克隆到载体质粒pBluescrip'SK中,经用光生物素标记的CAV-1 DNA杂交筛选以及Pst Ⅰ分析重组质粒证明已将分子量为5.5,3.5,2.85,1.2,0.32和0.28Kb的CAV-1DNA片段克隆到质粒中。克隆到的这些片段将可考虑进一步研究作为探针检测犬及狐狸等野生动物的腺病毒感染。

光生物素标记DNA探针对貂和犬细小病毒感染的检测

将貂肠炎病毒中间复制型DNA(MEV—RF—DNA)的Hind Ⅲ酶切C片段克隆到pBR332中,形成重组质粒pBM.以光生物素标记的pBM探针,检测接种细小病毒前的貂和犬粪样36份和12份,阳性率分别为36.1%和33.3%;检测接毒后不同时间的貂和犬粪样98份和71份,阳性率分别是90.8%和91.5%.探针对接毒前、后貂和大粪样检出的阳性率均明显高于常规HA试验.另外,对部分貂和大粪样进行了电镜检查和病毒分离试验,并与探针检测结果进行了比较.

犬Ⅱ型腺病毒DNA的快速提取及限制性酶切分析

按常规方法培养大肾传代细胞(MDCK),待细胞长成单层后,以2%的量接种犬Ⅱ型腺病毒弱毒株(MV-CAV_2).当绝大多数细胞出现病变时(约35～40h),直接从感染细胞培养物中提取CAV_2 DNA.以该法提取CAV_2 DNA,不仅操作简便、耗费少,而且产量也比常规的先纯化病毒再提取DNA的方法高2～3倍.该法可普遍用于从感染细胞中提取与蛋白共价结合的所有病毒核酸.采用电泳洗脱法纯化上述CAV_2 DNA,以Eco RI、Bam HI、Pst I、Sac I、Nsi I和Sph I酶切,电泳分离,建立了该病毒DNA的6种限制性内切酶图谱.本实验结果为该病毒DNA的分子克隆奠定了基础.