人血清淀粉样蛋白SAA1蛋白的原核重组表达

目的:重组及表达人血清淀粉样蛋白SAA1融合蛋白,为进一步制备早期诊断冠心病的单克隆抗体做准备。方法:应用PCR技术,以成人肝脏的c DNA文库做模板,扩增出长度为315 bp的人血清淀粉样蛋白SAA1基因,并将其分别与带有HIS标签的PET-32a载体及GST标签的PGEX-4T-1载体连接,转化入DH5α感受态细胞中进行克隆并测序鉴定。并在大肠杆菌表达菌BL21菌中表达SAA1融合蛋白,之后分别应用SDS-PAGE及Western blot技术检验重组蛋白的纯度。结果:经SDS-PAGE凝胶电泳后,我们分别看到了分子量为32k D和分子量为38k D的两个蛋白条带,这两个条带分别为PET-32a-SAA1重组蛋白和PGEX-4T-1-SAA1重组蛋白,且这两种蛋白在超声后存在于菌液的沉淀中,证明在大肠杆菌中实现了不溶性的包涵体形式的表达,经Western blot鉴定,分别以HIS标签抗体和GST标签抗体为第一抗体,以鼠二抗为第二抗体,证明所表达的蛋白质为SAA1融合蛋白。结论:采用原核表达方法,经免疫纯化可获得高纯度的SAA1融合蛋白,为进一步制备相应的单克隆抗体和开发以SAA1增高为指标之一的冠心病诊断试剂盒打下基础,为冠心病的诊断开辟新途径。

高同型半胱氨酸通过抑制SETDB1促进肝脂肪沉积

目的研究同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)和SET结构域分支型1(SET domain bifurcated 1,SETDB1)在肝脏脂肪沉积中的作用和分子机制。方法选取C57BL/6N雄性小鼠共14只。依据经典的Lieber-De Carli方法和高甲硫氨酸饮食(high methionine diet,HMD)建立酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)和高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)模型,将6只雄鼠随机分为对照组(pair fed,PF组)和酒精组(alcohol fed,AF组),每组3只,持续喂养5周,分别给予对照饲料和酒精液体饲料建立ALD模型;将8只雄性小鼠随机分为对照饲料饮食组(Chow组)与高甲硫氨酸饮食组(HMD组),每组4只,持续喂养5周建立HHcy模型。在AML12细胞中分别加入3.33μmol/L油酸(oleic acid,OA)、100μmol/L同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy),将OA与Hcy共同培养48 h,SETDB1 siRNA干扰AML12细胞6 h后培养至48 h。应用甘油三酯(triglyceride,TG)检测试剂盒和Hcy ELISA检测肝脏、血浆和细胞中TG和Hcy水平,使用qRT-PCR和Western blot检测肝脏及细胞SETDB1 mRNA、蛋白水平及其活性,提取细胞总RNA进行RNA表达芯片分析并富集功能通路。结果ALD小鼠模型出现肝脏脂肪沉积,AF组与PF组比较,血浆和肝脏Hcy水平增高,肝脏SETDB1表达和活性降低(P<0.05)。HMD中出现肝脏脂肪沉积,HMD组与Chow组比较,血浆和肝脏Hcy水平上升,肝脏SETDB1表达和活性降低(P<0.05)。外源Hcy导致AML12细胞SETDB1表达和活性下降,同时细胞内TG含量增加(P<0.05)。敲低SETDB1导致AML12细胞TG含量增加(P<0.05)。结论同型半胱氨酸通过抑制肝脏SETDB1表达和活性促进肝脏脂肪沉积。