PC12细胞硫氧还蛋白cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

硫氧还蛋白 (Thioredoxin ,TRX)是广泛存在于原核和真核细胞中的低分子量蛋白质 ,它含有保守的Cys Gly Pro Cys活性位点 ,作为多效性细胞因子而具有重要的生物学功能。从PC1 2细胞中提取总RNA ,经逆转录PCR(RT PCR)扩增出硫氧还蛋白cDNA并克隆到PUC1 8质粒上。序列分析表明 ,克隆所得序列与GenBank中大鼠硫氧还蛋白cDNA序列完全一致。将该基因亚克隆到表达质粒pQE30上 ,质粒pQE30 TRX在大肠杆菌M1 5中获得高效表达。带 6His的融合蛋白约占总菌体蛋白的 30 %。分析鉴定表明 ,纯化的融合蛋白质分子量是 1 4kD ,且具有二硫键还原酶活性。

PC12细胞APE/ref-1cDNA的克隆和表达

APE Ref 1是双功能核蛋白 ,它既能在碱基切除修复过程中切除脱嘌呤 脱嘌啶位点 ,又能促进包括AP 1、Myb和NF κB等受氧化还原调节的转录因子对DNA的结合 .从PC12细胞中抽提总RNA ,经逆转录PCR(RT PCR)扩增出APE ref 1cDNA并克隆到pQE3 1表达质粒上的BamHⅠ和PstⅠ位点间 .经测序表明 ,PC12细胞的APE ref 1cDNA以正确的阅读框架重组进入表达质粒 ,表达重组质粒pQE3 1 APE在宿主菌BL2 1中得到稳定表达 .SDS PAGE鉴定表明 ,带 6个组氨酸的融合蛋白分子量为 3 8kD ,并经Ni NTA琼脂糖亲和纯化得到电泳纯融合蛋白 .Western印迹证明重组蛋白为APE ref 1融合蛋白 .

重组成骨生长肽对同种异体骨移植愈合的实验研究

目的 观察重组成骨生长肽 (rOGP)对兔同种异体皮质骨移植愈合的影响。方法 采用日本大耳白兔造成桡骨中段 1.0cm缺损植以同种异体骨的动物模型 ,4 2只兔被分成实验组和对照组 ,每组 2 1只。从术后第 1天至取材的前 1天实验组动物每日经耳缘静脉注射rOGP 0 .5 μg/kg ,对照组注射同等剂量的生理盐水。于术后第 4 ,8,12周取材分别行大体、放射线和HE染色组织学观察愈合情况。结果 实验组和对照组组织愈合情况相似 ,实验组有多量的纤维结缔组织包裹连接处 ,放射线观察第 12周骨髓腔通畅及骨改建好于对照组。术后第 8,12周实验组移植骨和宿主骨连接处新生骨小梁多于对照组 (P <0 .0 5 )。

过氧化氢对PC12细胞中硫氧还蛋白和APE/Ref-1基因表达的影响

目的观察过氧化氢(H2O2)对硫氧还蛋白和APE/Ref-1基因表达的影响,探讨H2O2预处理对神经细胞具有适应性保护的分子机制。方法以PC12细胞作为神经细胞模型,以200和400μmol/L浓度的H2O2处理PC12细胞,用MTT法检测细胞的损伤程度,以Western blot方法测定硫氧还蛋白和APE/Ref-1表达水平。结果200μmol/LH2O2促进PC12细胞的硫氧还蛋白和APE/Ref-1表达,400μmol/LH2O2也促进PC12细胞的APE/Ref-1表达,但使PC12细胞的硫氧还蛋白表达显著降低。结论促进硫氧还蛋白和APE/Ref-1表达可能是低浓度H2O2预处理对神经细胞具有适应性保护的分子机制。

PC12细胞中氧化还原因子-1对过氧化氢和谷氨酸损伤的不同反应

目的通过研究PC12细胞抗氧化应激的氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redox factor1,APE/Ref-1)分子在过氧化氢和谷氨酸损伤过程中表达水平的变化,探讨谷氨酸对神经细胞损伤的分子机制。方法以PC12细胞作为神经细胞模型,以200和400μmol/L浓度的过氧化氢或以10和20mmol/L谷氨酸钠处理PC12细胞,用噻唑蓝法(MTT法)检测细胞的损伤程度,以Western blot方法测定APE/Ref-1表达水平。结果过氧化氢对PC12细胞的APE/Ref-1蛋白表达具有诱导作用。谷氨酸对PC12细胞的APE/Ref-1蛋白表达无影响。结论谷氨酸对PC12细胞的损伤过程中,所产生的氧化应激作用的水平很低,远不足以引起抗氧化应激的APE/ref-1蛋白的代偿反应。