药学分子生物学基因表达调控的教学体会

针对基因表达调控授课内容的自身特点,根据教学中的实际经验,总结四点教学体会:注重融会贯通、归纳总结;应用多媒体教学;补充科学最新进展;将自身科研经验运用到教学中。

讲好分子生物学课的几点体会

为了上好分子生物学,在教学中采用了理论与实验相结合使抽象的理论变得具体形象;动画'三次重复法'讲授生化反应;通过由感性认识上升为理性认识锻炼学生归纳总结能力;用联系的发展的思路学习分子生物学,防止固守僵化.

细胞色素P450 3A4抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P450 3A4（CYP3A4）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP3A4蛋白的序列,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列,合成CYP3A4多肽,与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联,免疫日本大耳白兔制备抗CYP3A4抗体。辛酸-硫酸铵法纯化抗体,间接ELISA测定抗体的效价及相对亲和力常数,Western blot鉴定其特异性,免疫组化进行定位。结果：获得针对小分子CYP3A4的抗体。该抗体效价为1∶16000;相对亲和力常数在10^5～10^6M^-1,具有实用价值;可与CYP3A4合成肽及天然CYP3A4出现特异性反应;可识别正常人肝脏组织CYP3A4;Western blot的结果显示,该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为46000。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP3A4合成肽抗体可应用于ELISA、Western blot和免疫组化实验。

重组人表皮生长因子的构建与表达

目的应用原核表达系统研究提高重组表皮生长因子(rhEGF)产量的方法。方法用RT-PCR方法克隆hEGF基因并插入表达载体pGEX-4T-1,获得重组的表达质粒pGEX-4T-1-hEGF转化大肠杆菌BL21并筛选得到工程菌株,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导目的蛋白表达,亲和层析纯化rhEGF,MTT法测定活性。结果成功扩增获得hEGF基因,部分表达产物为可溶性的、部分形成包涵体。菌体裂解上清液经亲和层析纯化后纯度达98%,复性后的rhEGF具有促细胞生长活性。结论成功构建并原核表达了重组人表皮生长因子基因,其表达产物具有很好的促细胞增殖活性。

小鼠抗人细胞色素P450 1A2合成肽抗血清的制备与鉴定

目的:制备小鼠抗人细胞色素P4501A2(CYP1A2)抗体及其特性鉴定。方法:利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列,根据4个指标(亲水性、柔韧性、抗原性及表面性)选择欲合成的多肽序列,设计、合成CYP1A2多肽。将其与载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyholelimpethemocya-nin,KLH)偶联,免疫BALB/c雌性小鼠制备抗CYP1A2抗体。用间接ELISA法测定抗体的效价,Westernblot鉴定其特异性。结果:成功地获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000,可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应。Westernblot的结果显示,该抗体识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为58000。结论:合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗体。制备的小鼠抗CYP1A2合成肽抗体的效价高及特异性良好。

兔抗人细胞色素P450 1A2多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P4501A2（CYP1A2）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列，根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列，合成CYP1A2多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联，免疫日本大耳白兔制备抗CYP1A2抗体。辛酸-硫酸铵法纯化抗体，间接ELISA法测定抗体的效价及相对亲和力常数，Western blot鉴定其特异性，免疫组化进行定位。结果：获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000；相对亲和力常数在10^5-10^6/M，具有实用价值；可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应；可识别正常人肝脏组织CYP1A2；Western blot的结果显示，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量为58000。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP1A2合成肽抗体可应用于酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组化实验。

乳腺癌相关的乳腺珠蛋白基因的克隆、表达及纯化

目的克隆人乳腺珠蛋白（hMAM）基因，原核表达重组蛋白并纯化，为建立一种新的乳腺癌诊断方法奠定基础。方法从人乳腺癌组织中提取总RNA，经RT-PCR合成cDNA，设计特异性的引物，用PCR的方法扩增出目的片段，构建PET-32A-hMAM和PGEX-4T1-hMAM表达载体，在BL21菌中表达hMAM重组蛋白，纯化，并进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果经RT-PCR、PCR扩增后得到一条207bp的DNA片段，构建载体后DNA测序，结果与预期序列一致。表达和纯化的融合蛋白相对分子质量大约为28000，与预期结果一致。结论成功克隆hMAM基因，并获得高纯度的hMAM重组蛋白，为进一步开发hMAM诊断试剂打下基础。

PEP06肽的成胶性及其解决方法的初步研究

目的开发一种避免PEP06肽形成凝胶从而消除药物凝胶有害作用的优化方法。方法选用不同溶剂研究溶剂对PEP06肽溶解性的影响;将PEP06肽放入装有氨水和浓盐酸容器内,研究pH对pEP06肽成胶性的影响;改变溶液的浓度,研究浓度对PETO6肽成胶性的影响;通过阳离子交换层析去除PEP06肽中的促成胶物质,解决PEP06的成胶问题。结果溶剂的种类影响PEP06肽的溶解性,在偏碱性的PBS缓冲液(pH=6.45)中药物的溶解性较差,在酸性的2%醋酸(pH=3.01)中溶解较好,溶剂对PEP06肽溶解性的影响可能与pH有关。溶液浓度与成胶性正相关,随着溶液浓度的增加,溶液逐渐地变得黏稠,直至形成凝胶。阳离子交换层析后的PEP06肽不再形成凝胶,推测影响PEP06肽成胶性的因素除了PEP06肽自身结构和上述因素外,溶液中可能还有一种能促进PEP06肽形成凝胶的物质,该物质能通过阳离子交换层析去除。结论确定了溶剂、浓度和pH对PEP06肽成胶性的影响;建立了通过阳离子交换层析解决PEP06肽的黏稠和成胶问题的方法,使得高浓度PEP06肽溶液能够通过微孔滤膜过滤,为大规模生产提供了技术支撑。

重组凋亡素组合肽(B9)的纯化及抗U251胶质瘤活性的研究

目的构建凋亡素组合肽(B 9)基因工程菌,建立重组凋亡素组合肽的纯化方法,在细胞水平上研究重组凋亡素组合肽抗U 251胶质瘤细胞活性。方法以PE T 28a质粒为表达载体构建凋亡素组合肽基因工程菌;经过等电点沉淀、PA A沉淀和阳离子交换层析纯化重组凋亡素组合肽;获得的充足凋亡素组合肽处理U 251细胞,检测细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭。结果建立了以等电点沉淀、PA A沉淀和阳离子交换层析为核心技术的纯化重组凋亡素组合肽的方法,纯化的凋亡素组合肽纯度达到了电泳纯。重组的凋亡素组合肽能诱导U 251细胞凋亡,抑制U 251细胞的增殖、迁移和侵袭。结论建立了纯化重组凋亡素组合肽的实验方法,重组凋亡素组合肽在细胞水平上诱导U 251细胞凋亡,抑制U 251细胞增殖、迁移和侵袭。