体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪

体细胞核移植转基因动物制作路线是目前生产转基因家畜的最佳方法.绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)转基因猪研究可以为转基因家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础.本研究对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体,构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究.结果显示,采用4.0μL/mL脂质体转染试剂,1.6μg/mL质粒DNA,转染6h可以获得最佳的转染效果,转染效率达3.61%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%;重构胚移植于10头受体后,有5头妊娠,3头受体发育到期,共出生克隆猪6头,其中4头为GFP阳性,经DNA检测确认为GFP转基因猪;转基因克隆胚胎移植出生率为1.0%,阳性个体出生率为0.7%.结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能.本研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值.

体细胞核移植克隆民猪:培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源,卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切.为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量,进而提高体细胞核移植猪的成功率,本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T),分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养,以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准,研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响.T,T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%,(69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%,添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率;3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著,但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25).来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管,其中有3头受体母猪妊娠发育到期,获得克隆民猪14头,其中有6头健康成活至今.实验结果表明,培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量,在含有10%pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.