哈尔滨维科生物技术开发公司动物实验中心的设计及管理体会

哈尔滨维科生物技术开发公司动物实验中心自2007年开始建设,2009年取得实验动物许可证(许可证号)并开始正式运行。一年多来,设施运转整体状况良好,现结合动物实验中心的设计以及管理等方面谈谈本人的一点体会。

H5N1亚型禽流感变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫原性研究

本实验对经反向遗传方法构建的重组禽流感H5N1亚型变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫效力进行研究。将Re-4株接种SPF鸡胚后37℃培养72h,鸡胚存活,无病变,HA滴度达29;以0.1mL(106.0EID50/0.1mL)的剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡7d后血清HI抗体转阳,无任何症状,也不排毒;SPF鸡静脉致病指数(IVPI)为0;以Re-4重组株为种毒制备灭活疫苗,免疫SPF鸡后,3周后平均HI抗体效价达8.75log2;免疫鸡对亲本强毒株CKSX/06,以及变异株CKNX/06和流行株GSGD/96攻击提供完全保护。以上结果表明变异株灭活疫苗种毒Re-4株对SPF鸡胚和SPF鸡无致病性、适合鸡胚增殖、抗原针对性强,并且以该毒株制备的灭活疫苗具有良好的免疫效力,是研制预防H5N1亚型禽流感病毒山西变异株的理想疫苗种毒株。

异齿盆口线虫的形态学观察及分子生物学鉴定

线虫动物门是最大的动物门之一，目前已有超过28000个物种被记录，其中寄生于马属动物体内的线虫不仅寄生数目庞大，而且种类繁多，涉猎线虫动物门的3个目、12个科，

一株pH1N1/2009猪流感病毒的进化分析与生物学特性研究

为了解SIV A/swine/Liaoning/5/2014(H1N1)分离株的生物学特性与遗传进化关系,本研究对该分离株的全基因序列进行测定,并对其进行小鼠致病性实验。基因组序列分析表明:该病毒的8个基因节段均来自A型H1N1流感病毒。HA蛋白裂解位点为^(325)PSIQSRG^(331),属于低致病性流感病毒的分子特征,其HA基因与A/Xia Men/SWL1280/2013(H1N1)的相似性达到98.9%。对动物致病性试验结果显示:该病毒可以感染哺乳动物模型BALB/c小鼠,但仅能够在鼠的肺脏和鼻甲骨粘膜上皮细胞中复制,病毒滴度分别为5.5 log_(10)EID_(50)/m L和3.3 log_(10)EID_(50)/mL,该病毒株对小鼠的生长具有抑制作用,可以导致感染后7 d内小鼠体质量下降15.2%,随后逐渐恢复,但始终低于正常对照小鼠,呈现一定的致病性。本研究为该病毒已在我国动物群体内流行提供了新的证据。

LAMP技术诊断猪支原体肺炎的应用研究

应用环介导等温扩增技术(LAMP)对猪支原体肺炎进行诊断应用研究,对来自黑龙江不同地区的患猪呼吸道疾病的肺脏病料64份进行检测,54份诊断为阳性,阳性率84.3%。健康猪鼻拭子共176份,经LAMP检测,157份为阳性,阳性率为89.2%。其中健康猪拭子带菌率较高,结果表明,LAMP技术可应用于猪支原体肺炎的临床诊断。

猪细小病毒检测技术研究进展

猪细小病毒病是由猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）感染引起以母猪繁殖障碍为主要特征的病毒性传染病，母猪妊娠前期感染该病毒后，经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等。近年来，该病呈上升趋势，给养猪业造成巨大的经济损失，引起了国内外众多科研工作者的广泛重视，已从各方面进行了深入研究。

兽用生物制品检验工作中的探讨(二)

2006年以后，中国内地再也没有暴发过大规模禽流感疫情，说明中国防治禽流感疫病的政策与方法是全面而有效的，其中国家拨款对农户鸡群实行禽流感疫苗强制免疫。以及禽流感疫苗过硬的质量功不可没。

鸡源抗体制备技术

现在用于研究、诊断以及治疗的抗体主要是来源于哺乳动物的单克隆抗体或多克隆抗体,但多抗和单抗的制备技术技术都有优点及不足。在单抗制备的过程中存在的主要问题是有一些抗原对小鼠是弱免疫原或根本没有免疫原性。在多抗生产和纯化的过程中,多数情况下从哺乳动物血液中制备抗体的产量很低,而且步骤繁琐。

标记疫苗与鉴别诊断检验技术的研究进展

随着分子生物学等相关学科的迅速发展,已开发出一系列更加安全有效的基因工程疫苗,这些疫苗具有将疫苗免疫动物与天然毒株感染动物区分开的潜力,由此产生了对研发高效标记疫苗与鉴别诊断检验技术的需求,文章对标记疫苗与相应的鉴别诊断检验技术的研发现状进行了分析与综述,以期为标记疫苗及相应鉴别诊断检验技术的研究与推广应用提供参考。

浅析猪腹泻性疾病的鉴别与治疗技术

猪腹泻性疾病是生猪养殖过程中常见的疾病之一,根据感染源的不同又可细分为猪痢疾、传染性肠胃炎、大肠杆菌病等。不同猪腹泻性疾病的治疗方式也有一定差异,如果养殖户不能及时、准确鉴别疾病种类,并采取有针对性的措施,就会导致猪大量患病,给养殖户造成严重的经济损失。该文结合实际工作经验,选取了几种有代表性的猪腹泻性疾病,提出了相应的治疗技术。

猪圆环病毒Ⅱ型病鉴别诊断技术的研究进展

猪圆环病毒（PCV）属于圆环病毒科，圆环病毒属，是一种无囊膜的二十面体的单链环状DNA病毒，该病毒有两个血清型：猪圆环病毒I型（PCV1）和猪圆环病毒II型（PCV2）。猪圆环病主要是由PCV2引起。本文旨在通过讨论PCV2的临床症状及鉴别诊断方法，为PCV2的现场及实验室鉴定提供理论依据。

免疫胶体金快速诊断技术在兽医诊断中的应用

免疫胶体金快速诊断技术源于对血清与尿液的绒毛膜促性腺激素的免疫渗滤试验检测,之后有学者提出采用胶体金作为标记物替代酶应用于渗滤试验,并制备完成广泛应用的对抗人类免疫缺陷病毒抗体检测的试剂盒.由于免疫胶体金快速诊断技术方便快捷,已在妊娠试验、检测传染病病原抗体等方面进行应用,而应用于兽医诊断的研究刚刚起步.

鸭疫里默氏杆菌诊断及检测技术研究进展

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella Anantipestifer，RA）是引起鸭等水禽类动物鸭疫里默氏杆菌病的病原，鸭疫里氏杆菌在入侵宿主后，迅速在感染位点定居、繁殖，经血液扩散到全身各组织器官，引起全身多发性浆膜炎，并发展为败血症。RA其血清型复杂，目前国际公认有21个血清型，我国也存在10多个血清型，而且还有新血清型和血清亚型的报道，各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，几乎所有血清型只与同源抗血清发生特异性反应。虽也有血清2型与17型，6型、12型和16型存在较弱的交叉反应的报道，但RA各血清型之间的抗原结构上确实存在较大差异，这给该病的诊断及免疫防治带来了诸多困难。本文就本病的诊断、检测有关研究情况进行综述，以便今后工作借鉴。

反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产中的应用

细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术在我国得到了广泛的推广和应用，特别是在动物疫苗生产领域取得了长足的发展。本文对细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产中的应用进行了分析。

我国数控技术和数控装备革新化战略研究

在新世纪到来时,如何有效解决数控技术和数控装备存在的问题,使我国数控领域沿着可持续发展的道路,从整体上全面迈入世界先进行列,将是数控研究开发部门和生产厂家所面临的重要任务。

猪氨基肽酶N病毒结合受体核心区对TGEV在ST细胞中复制影响的研究

为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N(pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响,本研究检索并分析pAPN与TGEV的结合位点,结果显示,敲除pAPN aa668~aa963对其酶活性无影响。因此,利用CRISPR/Cas9技术构建pAPN与TGEV结合位点敲除细胞系,经PCR和western blot鉴定结果显示,正确构建一株敲除pAPN aa668~aa963的ST细胞系,即敲除pAPN 15-21外显子,命名为KO-ST-15。采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响。利用RT-qPCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P<0.001)。利用RT-qPCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化,结果显示,TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3(NOD-like receptor protein 3)mRNA转录水平无显著变化,但RIG-I和MDA5的转录水平显著上调(P<0.05)。上述结果首次表明,敲除pAPN15-21外显子能够极显著抑制TGEV在ST细胞中的复制,但细胞KO-ST-15的正常生理功能无变化,TGEV不能进入敲除pAPN 15-21外显子的细胞中引起炎症反应,该结果为进一步培育抗病育种猪提供参考依据和候选方案。

2015～2016年我国东北地区猪病毒性腹泻流行病学调查

为了解东北地区(黑龙江省、吉林省和辽宁省)的猪病毒性腹泻发病情况和流行特点,本研究对2015年~2016年间东北地区的88个疑似病毒性腹泻猪场进行临床症状、发病猪日龄、发病时间、发病率、病死率等基本情况调查,并采用RT-PCR和抗原快速检测试剂盒对送检疑似病毒性腹泻仔猪粪便或肠道内容物264份样品进行病原检测。调查结果显示,疫情多发生在冬春寒冷季节。发病初期,后备猪、母猪或育肥猪呈一过性腹泻,发病率一般在1%以下,腹泻主要发生于哺乳仔猪,发病率高达87.97%,病死率高达89.90%。3个省份的7日龄以内仔猪发病率分别为62.52%、79.73%和75.00%,病死率为84.91%、80.87%和80.25%。随着日龄的增加,仔猪的发病率和死亡率呈明显递减趋势。病原学检测结果显示,传染性胃肠炎病病毒(TGEV)的阳性率为6.06%(16/264),猪流行性腹泻病毒(PEDV)的阳性率为74.62%(197/264),猪轮状病病毒(PoRV)的阳性率为25.76%。其中,单一病原感染以PEDV最高,感染率为48.86%,Po RV感染率为1.52%,TGEV感染率为0.38%。存在TGEV/PEDV、TGEV/PoRV、PEDV/PoRV混合感染和PEDV/TGEV/PoRV的3重感染,以PEDV/Po RV的双重感染为主。结果表明,东北三省份的猪病毒性腹泻发病率和死亡率均较高,主要病原以PEDV为主。该调查结果为东北地区养殖场猪病毒性腹泻的综合防控提供流行病学数据。

猪流行性腹泻病毒CH/S株N蛋白基因的遗传变异及其原核表达

应用RT-PCR和nested-PCR方法扩增得到含猪流行性腹泻病毒CH/S株N蛋白基因的目的片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析。CH/S株N蛋白基因含有一个长1326bp的ORF,编码由441个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失。CH/S与CV777、Chinju99、JS-2004-2和LJB/03N蛋白基因ORF的序列同源性分别为97.1%、96.8%、96.7%和96.5%;推导的氨基酸序列的同源性分别为97.7%、97.1%、97.1%和96.8%。以阳性质粒为模板,用分别含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的上、下游引物扩增得到ORF,其PCR产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到pET-30a载体,构建的重组质粒命名为pET-30a-PN;将pET-30a-PN转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达;SDS-PAGE结果表明表达出与预期大小相符的约54.4Ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;薄层扫描结果表明表达产物占菌体总蛋白的30.5%;Western blot分析表明表达的重组蛋白能与抗PEDV高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫学活性。

猪瘟兔化弱毒疫苗与猪圆环病毒2型灭活疫苗同时接种的免疫效果评价

为评价猪瘟兔化弱毒疫苗和猪圆环病毒2型(PCV2)灭活疫苗同时免疫效果,本实验采用猪瘟活疫苗(细胞源)和PCV2灭活疫苗(LG株)两种疫苗同时分点注射和混合注射35日龄仔猪,于免疫后间隔3周、5周、7周、9周采血,通过猪瘟病毒(CSFV)抗体检测试剂盒和PCV2抗体检测试剂盒进行CSFV和PCV2特异性抗体检测。结果显示,无论是两种疫苗同时颈部两侧分点分别注射,还是用PCV2灭活疫苗稀释CSFV活疫苗后混合免疫,免疫后3周CSFV和PCV2抗体均呈阳性,CSFV抗体滴度和PCV2抗体滴度于7周和9周达到峰值,与各疫苗单独免疫对照组抗体产生时间和滴度无明显差异。实验表明,两种疫苗可以同时注射或采用PCV2灭活疫苗稀释CSFV活疫苗进行免疫,均不影响各自免疫抗体的产生。因此,可以将PCV2灭活疫苗作为CSFV活疫苗的稀释剂,采用一次性注射的形式同时接种这两种疫苗,为简化这两种病临床疫苗免疫注射方面提供了实验依据。