牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性

采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牛乳腺上皮细胞。形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征;染色体分析结果表明,培养的细胞具有正常的染色体数目。通过荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白5和8。该细胞在添加胰岛素、氢化可的松以及羊催乳素的无血清培养液中诱导培养时,用RT-PCR方法检测到了β-酪蛋白基因的转录。这些结果表明,分离培养的细胞是乳腺上皮细胞,这些细胞在诱导培养的条件下能够转录表达β-酪蛋白。

富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISPs)在哺乳动物授精过程中的作用

雌雄配子间的结合与融合是哺乳动物授精成功的关键步骤,哺乳动物富含半胱氨酸的分泌蛋白CRISPs家族是一个进化上高度保守的蛋白家族,参与了精卵结合与融合过程,并在其中扮演了多种角色。目前从雄性小鼠生殖道中分离出4个CRISPs家族成员:附睾的CRISP1、睾丸的CRISP2、分布广泛的CRISP3以及与人CRISP1同源的CRISP4,对CRISPs家族蛋白成员的晶体结构分析揭示出CRISP蛋白含有两个功能域,一个是位于N末端的结构保守的CAP结构域,另一个是位于C末端的CRISP蛋白家族特有的CRISP功能域。CAP功能域中含有CAP基序,CRISP功能域由一个短的铰链区和一个离子通道调节区组成,并通过铰链区与CAP结构域相连接。简要回顾了各种CRISP蛋白的发现和特性鉴别过程,希望能从CRISPs的角度对哺乳动物精卵识别、结合与融合的分子机制有更好的了解。

哺乳动物精卵相互作用的分子机制的研究进展

哺乳动物受精是由一系列有序步骤组成的复杂细胞相互作用过程组成,最终导致精卵质膜融合形成受精卵。近来运用基因组学和蛋白质组学技术在哺乳动物精子和卵子表面鉴定出若干可能参与精卵质膜粘附与融合过程的蛋白分子,并对其结构和生物学功能进行了研究,但精卵识别与融合的分子机理仍然不清楚。综述了与精卵识别和融合有关的蛋白的最新研究进展,为进一步研究精卵相互作用的分子机制提供参考。

抗体分离纯化技术的研究进展

制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败。抗体的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化。重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法。对当前的纯化方法进行了一个简要的综述。

牛体细胞核移植技术研究进展

对近年来牛体细胞核移植技术研究的进展作一综述。其中包括:供体细胞种类、传代次数和所处细胞周期的选择;对供体细胞的特殊处理;卵母细胞的采集;传统去核方法的优化、去透明带核移植技术的建立与发展;胚胎重构、激活和体外培养条件的比较与改进等内容。

国产丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系转化能力的小鼠胚胎干细胞的分离

应用于胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)培养的国产药物可以降低ES细胞的实验成本。研究中以浙江海正药业生产的丝裂霉素(mitomycin,国药准字H33020786)处理小鼠胎儿成纤维细胞,用于胚胎干细胞建系。并制备饲养层,将小鼠囊胚种植在该饲养层上。4-6天后,挑选形态良好的内细胞团(inner cell mass)来源的克隆在胰酶中进行消化,将消化下来的细胞团块传至新鲜的饲养层上。之后,每2-3天传代一次。结果表明,经该丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系嵌合能力的胚胎干细胞的分离。

微滴培养技术的新应用

微滴培养技术在卵母细胞培养和胚胎早期发育研究中有广泛的应用。近期研究发现这项技术又有新的应用范围。有科学家发现将该技术应用于胚胎干细胞可以实现高效传代,在精原干细胞培养和精子发生相关过程的研究方面也可取得很好效果,同时,对早期人类胚胎干细胞的分离过程的监控和对精原干细胞生长过程的观察也相对容易。这些研究结果显示,微滴培养技术在这些新领域的研究与常规培养方法相比具有独特的优势。回顾微滴培养技术的主要发展过程,重点探讨微滴培养技术的最新应用及其优点。

哺乳动物睾丸中c-kit基因表达对生精细胞发育的影响

c-kit和SCF信号传递系统的特性已被广泛报道。但是哺乳动物c-kit基因的结构、功能、时空表达和c-kit突变动物模型相关的研究不多。由于研究方法的精度有差别,造成有些结果不清晰,有些结论还存在争议。该文对哺乳动物c-kit受体的结构和功能进行了阐述,并着重介绍了c-kit在模式动物和家畜生精过程中的表达形式及c-kit突变个体的相关研究进展。最终深入探讨了c-kit在生精细胞增殖、分化及受精过程中所起的作用。通过系统性介绍,明确c-kit在生精过程中起到的重要作用,为生精细胞的增殖、分化及迁移等机理的进一步研究提供了参考。

山羊精原干细胞的分离纯化及鉴定

旨在探究1种简便高效分离纯化山羊精原干细胞的方法。采用三步酶消化对4月龄的山羊睾丸进行处理,分离获得单细胞悬液。将细胞依次培养于明胶、大鼠鼠尾胶原和层粘连蛋白涂层的细胞培养皿中,根据各类细胞贴壁能力和贴壁速度不同进行精原干细胞的富集和纯化,并在各步纯化过程中用精原干细胞特异标记分子PLZF和CDH1进行免疫荧光标记染色鉴定,统计精原干细胞所占的比率,并对获得的细胞进行初步培养和鉴定。每克睾丸中分离出1.36×107个细胞。纯化后每克睾丸组织获得8.7×104个细胞,其中精原干细胞纯度达87.0%。将分离纯化后的细胞在体外培养可形成细胞簇,并表达精原干细胞标记分子CDH1和PLZF。结果表明,通过三步酶消化和差异贴壁方法已经建立起山羊精原干细胞的分离纯化技术。用此技术纯化的山羊精原干细胞(SSCs)能在体外培养增殖,形成细胞簇。

mTOR信号通路与细胞生长调控

mTOR(the mammalian target of rapamycin)是一个进化上十分保守的蛋白激酶,属于PIKK(the phosphatidylinositol kinase-related kinase)超家族,作为Ser/Thr激酶而起作用。它可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境压力对细胞的刺激信号,进而通过下游效应器(4EBP1和S6Ks)调节细胞生长。mTOR信号通路还影响胚胎干细胞和早期胚胎的发育,并且与肿瘤、肥胖及代谢紊乱等疾病有关。对mTOR信号通路的生理功能、分子组成和调节机制的研究不仅可以深入了解细胞生长调控的机制,而且对于相关疾病的治疗具有重要意义。

大蓟对5种癌细胞抑制作用的研究

目的:研究大蓟对癌细胞生长的抑制作用。方法:细胞形态观察、活细胞计数法和克隆形成率法研究大蓟对人白血病细胞K562、肝癌细胞HepG2、宫颈癌细胞Hela、胃癌细胞BGC823、结肠癌细胞HT-29生长的抑制作用。结果:大蓟可使五种癌细胞形态上发生皱缩、变圆、脱壁、裂碎等变化,生长受到明显抑制,抑制率最高可达81.73%。结论:大蓟有确切的抑癌作用。

微生态制剂对奶牛产奶性能及日粮营养物质消化率的影响

微生态制剂与抗生素相比,具有无残留、安全、不产生耐药性等特点,符合饲料生产安全无公害的发展趋势。目前,有关微生态制剂在奶牛实际生产中应用效果的研究报道较多,且多数研究结果得出,

小蓟水提液对4种癌细胞生长抑制作用的研究

目的:研究小蓟水提液对癌细胞生长的抑制作用。方法:细胞形态观察、活细胞计数法和克隆形成率法研究小蓟水提液对人白血病细胞K562、肝癌细胞HepG2、宫颈癌细胞Hela、胃癌细胞BGC823生长的抑制作用。结果:小蓟水提液可使4种癌细胞形态上发生皱缩、变圆、脱壁、裂碎等变化,生长受到明显抑制,抑制率最高可达86.03%。结论:小蓟有确切的抑癌作用。

用精原干细胞移植技术制作转基因动物的研究前景

在生物科学、生物医学、畜牧业科学和生物反应器的研究中,转基因动物是非常有用的工具.然而,最常用的制作转基因动物的方法,如原核显微注射和核移植效率都非常低.在最近10年中,研究人员利用精原干细胞移植技术发明了一系列新方法.其中的一些方法一旦与遗传修饰方法相结合,就会形成一套制备转基因动物的新方法.本文综述了与转基因动物制作相关的精原干细胞移植研究成果,如精原干细胞移植技术、精原干细胞的冷冻保存方法、精原干细胞移植受体的准备、精原干细胞的长期增殖和传代培养、精原干细胞的遗传修饰及外源基因的遗传特性等,描述了用精原干细胞移植技术制作转基因动物的一整套方法.根据所用供体和受体的不同,将这种新的转基因动物制作方法分为两类:同种移植法和同体移植法.这一研究领域的进展虽然迅速,但是每一种方法仍然有潜在的困难有待于克服.本文对这些新方法的优点和目前存在的问题进行了探讨.

白绒山羊性控胚胎生产及移植应用研究初探

应用X性控冷冻精液对超排供体白绒山羊进行人工授精,生产性控胚胎并进行鲜胚移植。结果发现,①用性控冻精和鲜精输精的供体母羊,平均卵子回收数分别为13.3和12.5枚,其中性控冻精组受精卵比例为29.6%(55/186),极显著低于鲜精组94.0%(281/299)的比例(P<0.01);②性控胚胎和普通胚胎移植受体母羊产羔率分别为42.2%和58.1%,二者差异极显著(P<0.01);③性控胚胎移植受体母羊所产羔羊雌性所占百分数为100%,极显著高于普通胚胎移植(P<0.01)。表明通过白绒山羊X、Y精子分离、人工授精生产性控胚胎,同时结合胚胎移植技术,可以达到按照生产实际中的意愿得到性别控制子代白绒山羊的目的。

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞

【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(NM_001002885)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。

内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染

【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV(6.3 kb)。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。

昆明白小鼠胚胎干细胞分离与体外培养

为探索昆明白小鼠胚胎干细胞建系方法,将受孕4.5天的昆明白小鼠囊胚用免疫手术法去除滋胚层,然后将内细胞团(ICM)接种于胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,形成的胚胎干细胞样集落用胰蛋白酶-EDTA消化法传代,培养后进行相差显微镜观察及碱性磷酸酶染色。结果饲养层上生长的ICM细胞呈典型的ES样细胞集落,传至第8代碱性磷酸酶染色呈强阳性。实验表明免疫手术法适用于昆明白小鼠ES细胞建系,获得的细胞集落具有ES细胞的主要生物学性状。

内蒙古白绒山羊蛋白激酶B/AKT基因的克隆及表达模式分析

【目的】克隆内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA并分析其基本表达模式。【方法】RT-PCR克隆AKT基因cDNA。通过在线软件BLAST进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。半定量RT-PCR检测AKT基因在绒山羊组织中的表达特异性。Western blotting检测绒山羊胎儿成纤维细胞中AKT表达。【结果】克隆到的内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA片段长1 443 bp,包含了编码480个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与绵羊(NM_001161857.1)同源性为97%。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了可与3-磷酸肌醇结合的PH结构域及具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域。Psite分析表明,含有1个cAMP-/cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、10个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个蛋白激酶ATP结合区信号和1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区域。PSORT程序预测其定位于细胞质中。AKT基因mRNA丰度在睾丸、脑和肾中较高,在脾、肝、肺及乳腺组织中相对低。绒山羊胎儿成纤维细胞中抑制mTOR活性,AKT表达量降低。【结论】内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA全长ORF的核苷酸序列与绵羊的AKT基因具有很高的同源性,AKT基因在脾、睾丸、脑、肝、肺、乳腺及肾组织中均有表达,其AKT的表达受mTOR信号通路的调控。

粘附斑激酶(FAK)及其信号通路研究进展

粘附斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一类胞质非受体蛋白酪氨酸激酶,属于蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase)超家族,因而也称为PTKⅡ。FAK在细胞信号转导中处于十分重要的位置,它是胞内外信号出入的中枢,介导多条信号通路。FAK可以整合来自整合素、生长因子以及机械刺激等的信号,激活胞内PI3K/Akt、Ras/MAPK等信号通路,调节细胞生长。FAK还与胚胎发育、肿瘤发生与迁移有关。