骨髓间充质干细胞移植对蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤的治疗作用及机制

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠早期脑损伤(EBI)的治疗作用及机制。方法将健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、蛛网膜下腔出血(SAH)组、BMSC组、VitE组,每组10只,采用血管内穿刺法构建SAH模型。分离、培养、鉴定BMSC。造模后24 h,将第4代BMSC 3×10^(6)个重悬于0.6 mL PBS中,经股静脉注入BMSC组;假手术组、SAH组、VitE组经股静脉注入等量PBS。VitE组给予维生素E(100 mg/kg)灌胃,其他组给予等量橄榄油灌胃。造模后48 h,用改良Garcia评分评估大鼠的神经功能,计算脑组织水含量,用HE染色法观察脑组织病理变化,统计坏死的神经细胞数量,普鲁士蓝染色(铁染色)法检测脑组织铁沉积情况,吸光光度法检测脑组织铁含量、MDA、GSH,Western blotting法检测脑组织NOX2蛋白,ROS探针法检测脑组织ROS。结果与假手术组比较,SAH组改良Garcia评分低,脑组织含水量高,SAH组神经细胞坏死数量多,脑组织中铁沉积量、铁含量、MDA含量高,GSH含量低,脑组织中NOX2蛋白表达、ROS水平高(P均<0.05);与SAH组比较,BMSC组、VitE组改良Garcia评分高,脑组织含水量低,神经细胞坏死数量少,脑组织中铁沉积量、铁含量、MDA含量低,GSH含量高,脑组织中NOX2蛋白表达、ROS水平低(P均<0.05)。除改良Garcia评分外,BMSC组、VitE组以上其他指标比较差异有统计学意义(P均<0.05)。假手术组神经细胞形态规则,均匀;SAH组神经细胞排列紊乱,细胞核破碎;与SAH组比较,BMSC组神经细胞损伤情况明显改善;VitE组神经细胞损伤修复情况比BMSC组弱。结论BMSC移植可有效治疗SAH大鼠EBI,其作用机制可能通过NOX2/ROS通路调控铁死亡。

神经细胞铁死亡在蛛网膜下腔出血大鼠脑组织中的表达及其作用

目的 探究神经细胞铁死亡在蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)大鼠早期脑损伤(early brain injury, EBI)期间的表达情况及其神经功能损害的关系。方法 48只健康雄性SD大鼠被随机分为4组:假手术组(Sham组)、蛛网膜下腔出血组(按造模后取材时间不同分为3个亚组:SAH 6 h组、SAH 24 h组、SAH 72 h组),每组12只。用血管内穿刺法进行SAH造模,Sham组大鼠仅行血管穿刺,但不刺破血管。参照Garcia评分表检测各组大鼠的神经功能评分,干湿重法脑组织含水量;HE染色观察神经细胞形态并统计坏死数量,普鲁士蓝染色观察脑组织中铁沉积情况;吸光光度法检测各组大鼠脑组织铁含量、脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)活性,标准曲线法检测谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量。结果 与Sham组比较,SAH 6 h、24 h、72 h组大鼠的神经功能评分显著降低(P<0.05)。与Sham组比较,SAH 24 h、72 h组大鼠脑组织含水量明显升高(P<0.05),但SAH 6 h组差异无统计学意义(P>0.05)。与Sham组比较,SAH 24 h、72 h组大鼠脑组织海马CA1区神经元细胞坏死数明显增多(P<0.05),SAH 6 h组神经元细胞坏死数量差异无统计学意义(P>0.05)。普鲁士蓝染色结果显示,在Sham组脑皮质组织中,没有发现明显的铁沉积,SAH 6 h组脑皮质组织中有少量铁沉积;与Sham组比较,SAH 24 h、72 h组大鼠脑组织中铁沉积明显增多(P<0.05)。与Sham组比较,SAH 24 h、72 h组大鼠脑组织中铁含量、MDA含量明显增加(P<0.05),GSH含量和GPX4活性显著降低(P<0.05)。结论 神经细胞铁死亡在SAH大鼠EBI期间出现,且呈时间依赖性,72 h最为严重;其可能与神经功能损害有关。

头孢曲松对蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤脑皮质Nrf2/GPX4通路及铁死亡的影响

目的探究头孢曲松(ceftriaxone,CTX)对蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)大鼠早期脑损伤(early brain injury,EBI)脑皮质核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)通路及铁死亡的影响。方法将48只清洁级雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组(Sham组)、蛛网膜下腔出血组(SAH组)、蛛网膜下腔出血+头孢曲松组(SAH+CTX组)和蛛网膜下腔出血+头孢曲松+Nrf2抑制剂组(SAH+CTX+ML385组),每组12只。在造模前7 d,经腹腔注射给予SAH+CTX+ML385组大鼠ML385(30 mg·kg^(-1))干预,1次/d,连续7 d;在造模前5 d,经腹腔注射给予SAH+CTX组和SAH+CTX+ML385组大鼠CTX(200 mg·kg^(-1))处理,1次/d,连续5 d;Sham组和SAH组大鼠给予等体积0.9%氯化钠溶液。造模24 h后,对各组大鼠进行神经功能评分与脑组织含水量测定,HE染色观察海马CA1、CA3区神经细胞形态,普鲁士蓝染色观察脑皮质中铁沉积情况,分光光度计法测定脑皮质中铁含量、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)含量、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量及GPX4活性,Western blot检测脑皮质中Nrf2和GPX4蛋白表达水平。采用SPSS 23.0进行统计学分析,多组样本均数的比较采取单因素方差分析,组间两两比较采用Dunnett-t检验。结果4组大鼠SAH后24 h神经功能评分差异有统计学意义(F=48.40,P<0.001),SAH组大鼠SAH后24 h神经功能评分低于Sham组和SAH+CTX组(均P<0.05)。4组大鼠SAH后24 h脑含水量差异有统计学意义(F=49.61,P<0.001),SAH组大鼠SAH后24 h脑含水量高于Sham组和SAH+CTX组(均P<0.05)。4组大鼠SAH后24 h海马CA1、CA3区神经细胞坏死数均差异有统计学意义(F=17.44,246.50,均P<0.001),SAH组大鼠海马CA1、CA3区神经细胞坏死数均多于Sham组和SAH+CTX组,SAH+CTX+ML385组大鼠海马CA1、CA3区神经细胞坏死数均多于SAH+CTX组(均P<0.05)。4组大鼠SAH后24 h脑皮质中铁沉积量差异有统计学意义(F=2363.0,P<0.001),SAH组大鼠脑皮质中铁沉积量多于Sham组、SAH+CTX组(均P<0.05)。4组大鼠SAH后24 h脑皮质中铁含量、MDA含量、GSH含量及GPX4活性均差异有统计学意义(F=2380.0,1322.0,789.1,815.5,均P<0.001);SAH组大鼠脑皮质中铁含量和MDA含量均高于Sham组,GSH含量和GPX4活性均低于Sham组(均P<0.05);SAH+CTX组大鼠脑皮质中铁含量和MDA含量均少于SAH组,GSH含量和GPX4活性均高于SAH组(均P<0.05)。4组大鼠SAH后24 h脑皮质中Nrf2和GPX4蛋白表达水平均差异有统计学意义(F=888.7,1556.0,均P<0.001)。SAH组大鼠脑皮质中Nrf2(0.382±0.014)及GPX4(0.329±0.019)蛋白表达水平均低于Sham组[(0.746±0.009),(0.953±0.009)](均P<0.05);SAH+CTX组大鼠脑皮质中Nrf2(0.631±0.006)及GPX4(0.833±0.008)蛋白表达水平均高于SAH组(均P<0.05);SAH+CTX+ML385组大鼠脑皮质中Nrf2(0.427±0.009)和GPX4(0.525±0.011)蛋白表达水平均低于SAH+CTX组(均P<0.05)。结论CTX可能通过调控Nrf2/GPX4信号轴抑制SAH大鼠EBI期间脑皮质铁死亡的发生。