Survivin-siRNA对骨肉瘤MG-63细胞药物敏感性的研究

目的研究特异性Survivin-siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞后对骨肉瘤细胞药物敏感性的影响。方法应用两种特异性Survivin-siRNA(Survivin-siRNA1,Survivin-siRNA2)转染骨肉瘤MG-63细胞,RT-PCR检测MG-63细胞Survivin-mRNA表达,流式细胞术检测MG-63细胞的凋亡,MTT法检测顺铂、多柔比星对转染前后MG-63细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果特异性Survivin-siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞24h后SurvivinmRNA表达水平明显抑制;流式细胞术显示转染Survivin-siRNA的MG-63细胞48h后凋亡率明显高于非特异性siRNA组和空白对照组(F=17.32,P<0.01);特异性Survivin-siRNA增强了MG-63细胞对多柔比星的敏感性5倍,增强了MG-63细胞对顺铂的敏感性9倍。结论化学合成的Survivin-siRNA能有效抑制Survivin基因在骨肉瘤MG-63细胞中的表达,并提高MG-63细胞对多柔比星、顺铂的敏感性。

RNAi对骨肉瘤MG-63细胞survivin基因表达抑制作用

背景与目的:骨肉瘤是青少年中最常见的恶性肿瘤,它恶性程度高,预后差。survivin基因是作用最强的凋亡抑制因子,其表达与肿瘤的恶性程度及患者预后密切相关。本实验应用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术研究特异性survivin-siRNA对骨肉瘤MG-63细胞survivin基因表达的干扰作用,并对RNAi技术在骨肉瘤基因治疗领域中应用的可能性进行初步分析。方法:将化学合成的特异性survivin-siRNA1和特异性survivin-siRNA2在脂质体的介导下转染骨肉瘤MG-63细胞,应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和流式细胞术检测转染前后MG-63细胞中survivin-mRNA和蛋白水平,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法来评估特异性survivin-siRNA对骨肉瘤MG-63细胞的抗增殖作用,观察MG-63细胞生物学特性的改变。结果:特异性survivin-siRNA降低了骨肉瘤MG-63细胞survivin mRNA和蛋白的表达水平,干涉后细胞的增殖受到抑制。结论:化学合成的survivin-siRNA能有效抑制survivin基因在骨肉瘤MG-63细胞中的表达,并对骨肉瘤MG-63细胞增殖有抑制作用。

洛伐他汀联合降钙素治疗骨质疏松大鼠骨折的效果分析

目的探讨洛伐他汀单独或联合降钙素对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响。方法 4月龄雌性SD大鼠40只,随机分为正常骨折(A)组、骨质疏松性骨折(B)组、洛伐他汀治疗(C)组、降钙素治疗(D)组和联合治疗(E)组,每组8只。A组行假手术,B、C、D、E组行双侧卵巢摘除术,术后8周制作股骨干骨折模型,骨折后8周处死大鼠。采用ELISA法检测血Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP),X线摄片及评分观察骨折愈合情况,骨密度检测骨折侧股骨骨密度,生物力学分析骨折侧股骨最大载荷。结果 (1)血清PINP水平:A组显著低于其余各组,C、E组显著高于B组,D组显著低于C组。(2)X线示A、E组愈合良好,B组多数标本可见模糊骨折线,C、D组略好于B组。评分结果:A、E组显著高于B、C、D组。(3)骨密度:股骨全长及中段骨密度A组最高,E、D、C组次之,B组最小。(4)最大载荷:A组大鼠骨折侧股骨最大载荷显著高于其余4组,E组显著高于B组。结论骨质疏松大鼠骨量下降、骨折愈合进程延迟,洛伐他汀联合降钙素较单独应用可更有效地抑制骨质疏松大鼠骨量的丢失并促进骨折的愈合。

唑来膦酸联合胰岛素促进2型糖尿病并发雌激素缺乏大鼠骨折早期愈合

目的探讨唑来膦酸联合胰岛素对于2型糖尿病并发雌激素缺乏大鼠早期骨折愈合的影响。方法 32只雌性SD大鼠随机分为CF、DOF、DOFI和DOFIZ 4组。除CF组外,其余3组建立2型糖尿病并发雌激素缺乏动物模型,其中DOFI组和DOFIZ组分别给予单独胰岛素或联合唑来膦酸治疗,骨折后3周取材。通过对骨痂X线片、Micro-CT、番红O-固绿染色、TRAP阳性破骨细胞密度、OCN和Caspase-3的表达进行分析,评价单独应用胰岛素或联合唑来膦酸对其早期骨折愈合的影响。结果DOF组骨痂的骨折愈合X线评分、Tb.N、BV/TV、骨性骨痂面积比和OCN表达均显著低于CF组(P<0.05),Th.Sp、TRAP阳性破骨细胞密度和Caspase-3表达均显著高于CF组(P<0.05)。胰岛素干预后,DOFI组以上各受损指标中除了Th.Sp外均得到显著改善(P<0.05)。联合唑来膦酸干预后,DOFIZ组骨痂面积、Tb.N、BV/TV和骨性骨痂面积比显著高于DOFI组(P<0.05),Th.Sp和TRAP阳性破骨细胞密度显著低于DOFI组(P<0.05)。结论胰岛素联合早期单剂量唑来膦酸干预可促进2型糖尿病并发雌激素缺乏大鼠骨折早期愈合。

洛伐他汀联合胰岛素干预双侧卵巢切除2型糖尿病SD模型大鼠骨折的愈合

背景:2型糖尿病骨质疏松女性骨折患者,往往伴随血脂异常,在给予胰岛素控制血糖的同时,还常需应用他汀类药物联合治疗,但是这2种药物联合应用对于此类患者骨折愈合有何影响还未见报道。目的:探讨洛伐他汀联合胰岛素对于去卵巢2型糖尿病大鼠骨折愈合过程的影响。方法:实验方案经华北理工大学实验伦理委员会批准。雌性SD大鼠32只随机分为正常对照组、2型糖尿病并发骨质疏松骨折组、胰岛素治疗组和胰岛素联合洛伐他汀组。除正常组外,所有大鼠建立2型糖尿病并骨质疏松骨折大鼠模型,胰岛素治疗组和胰岛素联合洛伐他汀组大鼠在注射链脲佐菌素7d建立2型糖尿病模型成功后,行皮下注射胰岛素直至实验结束,胰岛素剂量为早2-4U、晚4-6U;其余2组不做处理;胰岛素联合洛伐他汀组大鼠每日给予20 mg/kg洛伐他汀灌胃。在骨折后第3周时麻醉后处死大鼠,通过对各组骨痂进行影像学、临床检测及组织形态学分析,并检测其内骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子和Ⅱ型胶原蛋白的表达,来分析各组大鼠骨折愈合情况。结果与结论:(1)2型糖尿病并发骨质疏松骨折组大鼠骨折愈合X射线评分、Micro-CT各项指标、组织形态学评分及血管内皮生长因子、Ⅱ型胶原蛋白的表达均较正常骨折对照组出现显著受损(P<0.05);(2)经胰岛素治疗后,胰岛素治疗组以上指标均较2型糖尿病并发骨质疏松骨折组显著改善(P <0.05),促进了模型大鼠骨折愈合;(3)但在胰岛素治疗基础上联合洛伐他汀治疗后,虽然进一步促进骨痂内血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达(P <0.05),但是对于骨折的影像学表现和骨痂组织的微结构并无显著改善。

雷奈酸锶对大鼠应力缺失性骨丢失的防治作用

目的探讨雷奈酸锶对尾悬吊导致的应力缺失性大鼠骨质疏松的防治效果。方法 6月龄SD大鼠30只,随机均分为3组:正常对照组(A组)、尾悬吊组(B组)、雷奈酸锶干预组(C组)。B、C两组大鼠采用尾悬吊法制备应力缺失型骨质疏松大鼠模型,C组给予1 g/(kg·d)雷奈酸锶干预,4周后处死所有大鼠,取左侧股骨检测骨密度,取左侧胫骨制备非脱钙组织切片并行骨形态计量学检测,取右侧股骨和胫骨骨髓细胞体外培养并向成骨细胞诱导分化,取第4代细胞及血清检测骨钙素(OCN)的表达。结果 B组骨密度低于A组,C组高于B组(P<0.05)。B组骨小梁体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)低于A、C组,破骨细胞数(Oc.N)、骨吸收长度比(Er.Pm)高于A组,C组骨形成率(BFR/BV)、矿化长度比(L.Pm)高于B组,Er.Pm、Oc.N低于B组(P<0.05)。B、C组OCN m RNA表达水平高于A组,但血清中OCN水平B组低于A、C组(P<0.05)。结论尾悬吊4周可造成大鼠骨丢失,雷奈酸锶可抑制其骨量丢失,作用机制可能与其通过上调OCN的表达促进骨形成有关。

雷奈酸锶对卵巢切除大鼠BMSCs成骨分化及BMP-2表达的影响

目的探讨雷奈酸锶(SR)对卵巢切除大鼠骨髓基质干细胞成骨分化及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)表达的影响。方法3月龄SD大鼠24只,分别接受假手术(Sham组,n=8)和双侧卵巢切除(OVX,n=16)手术,术后8周OVX大鼠分为2组,分别接受安慰剂(OVX+V组)或SR(0.9g·kg-1·d-1,OVX+SR组)治疗3个月。实验结束后处死所有大鼠,检测第4腰椎骨密度、最大载荷、弹性模量等生物力学性能,取股骨和胫骨骨髓细胞进行体外培养并向成骨细胞诱导分化,第25天共聚焦显微镜观察BMP-2的表达及分布,第28天提取细胞RNA及蛋白,RT-PCR及Western blot法检测BMP-2的表达,细胞培养第32天von kossa染色观察细胞外基质矿化能力。结果 (1)骨密度:OVX+V组显著低于Sham组和OVX+SR组(P<0.05),OVX+SR组显著低于Sham组。(2)最大载荷:OVX+V组显著低于OVX+SR组(P<0.05),OVX+SR组显著低于Sham组(P<0.05);弹性模量:OVX+V组显著低于Sham组和OVX+SR组(P<0.05)。(3)共聚焦显微镜观察各组细胞BMP-2的表达及胞内分布无明显差异。(4)RT-PCR及Western blot法检测BMP-2在各组的表达差异无统计学意义。(5)von kossa染色观察各组矿化面积百分比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 SR可部分改善卵巢切除大鼠骨量丢失和力学性能,对其骨髓基质干细胞体外成骨分化能力及BMP-2的表达无显著影响。

辛伐他汀对DH豚鼠自发性膝骨性关节炎关节软骨退变的影响

目的探讨辛伐他汀灌胃干预对DH豚鼠原发性膝骨关节炎(OA)关节软骨退变的影响。方法 3个月龄DH豚鼠18只,6只在实验开始时处死(基线组),其余12只分别给予辛伐他汀(20 mg·kg-1·d-1)(辛伐他汀组)或生理盐水灌胃(对照组),6个月后处死所有动物。留取静脉血备行酶联免疫吸附(ELISA)检测分析白细胞介素(IL)-1β的表达;取膝关节股骨行常规石蜡包埋,经Van Gieson(VG)染色及国际骨性关节炎研究协会(OARSI)评分,评价软骨退变情况,免疫组化染色检测IL-1β的表达;对胫骨软骨下骨行Micro-CT分析骨密度(BMD)、相对体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)及结构模型指数(SMI)。结果 1血清学指标:辛伐他汀组和对照组IL-1β水平显著高于基线组,辛伐他汀组显著低于对照组(P<0.05);2关节软骨组织学评价:与基线组相比,对照组关节软骨出现退变表现,OARSI评分显著升高(P<0.05),辛伐他汀组与对照组无显著差别;3免疫组化染色结果提示辛伐他汀组和对照组关节软骨IL-1β的表达水平显著高于基线组,但辛伐他汀组和对照组无显著区别;4软骨下骨Micro CT检测结果:辛伐他汀组及对照软骨下骨BMD、Tb.Th显著高于基线组,SMI显著低于基线组(P<0.05),辛伐他汀组与对照组无显著差别。结论辛伐他汀系统性干预可降低DH豚鼠血IL-1β水平,但不能抑制其膝关节软骨自发性退变及软骨下骨骨量和微观结构的改变。

RNA干扰C-erbB-2对肺腺癌细胞calu-3增殖的影响

背景与目的:C-erbB-2基因在人乳腺癌、卵巢癌、肺癌中扩增及过量表达,与肿瘤恶性程度增高、转移能力增强、化疗抵抗密切相关,且与预后不良有关。RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是一种新的基因治疗技术,能有效、特异性地抑制细胞内基因表达。本实验研究靶向C-erbB-2基因的siRNA(small interferingRNA)对C-erbB-2过表达的肺腺癌细胞calu-3增殖的影响。方法:化学合成的靶向C-erbB-2基因siRNA在脂质体的介导下转染calu-3细胞,观察转染前后细胞表型的改变;通过逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)和流式细胞术检测转染前后细胞中C-erbB-2mRNA和蛋白水平的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法评价对calu-3细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期的变化和细胞凋亡情况。结果:靶向C-erbB-2基因siRNA降低了calu-3细胞中C-erbB-2mRNA和蛋白的表达,转染C-erbB-2siRNA48h后calu-3细胞出现C-erbB-2蛋白表达下调。C-erbB-2蛋白阳性率为(25.04±1.56)%,与未转染对照组、空载体组、非特异性siRNA组比较[(98.24±2.23)%、(95.67±1.98)%和(94.79±0.87)%]有显著性差异(P<0.01)。同时C-erbB-2siRNA对calu细胞增殖有抑制作用,使细胞周期阻滞于G0/G1期[C-erbB-2siRNA组(56.6±3.6)%,未转染对照组(45.5±3.2)%,P<0.01],并能诱导细胞凋亡。结论:化学合成的靶向C-erbB-2基因siRNA能有效抑制C-erbB-2基因在calu-3细胞中的表达,并对calu-3细胞增殖有抑制作用。

MRI在膝关节隐匿性骨折诊治中的意义

目的探讨膝关节隐匿性骨折的MRI特点及临床应用价值。方法回顾性分析35例膝关节隐匿性骨折病例的X线片、MRI资料,其中4例4周后复查。结果全部病例X线检查均为阴性。MRI检查全部阳性,典型表现为SE序列不规则片状T1WI低信号、T2WI高信号。结论MRI检查是诊断隐匿性骨折的最佳影像学方法,同时还可以发现其他合并损伤。

洛伐他汀对BMSCs成骨分化不同阶段Cbfa1、BMP-2表达的影响

目的研究洛伐他汀促进大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中特异性基因Cbfa1、BMP-2 mRNA表达的影响。方法取6周雌性SD大鼠的双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外成骨诱导培养,于第一次传代后加入浓度为5μmol/L洛伐他汀或等量溶剂培养,分别于细胞培养第十四、二十一、二十八天提取RNA,并采用realtime RT-PCR法于上述时间点检测Cbfa1、BMP-2mRNA的表达,细胞培养至35d,采用茜素红染色观察细胞外基质矿化能力。结果①洛伐他汀可促进成骨诱导分化大鼠BMSCs细胞外基质的矿化能力。②mRNA表达水平:第十四天干预组Cbfa1的表达显著高于对照组,BMP-2的表达水平无显著组间差别;第二十一天干预组Cbfa1、BMP-2的表达均显著高于对照组;第二十八天BMP-2表达显著高于对照组,Cbfa1的表达无组间差别(P<0.05)。结论洛伐他汀可促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化,其作用机制可能与在其分化不同阶段调控Cbfa1、BMP-2的表达有关。

Her-2/neu小分子干扰RNA对肺腺癌细胞周期和凋亡机制的影响

目的研究人类表皮生长因子受体2(Her2/neu)小分子干扰RNA(siRNA)对Her2/neu过表达的肺腺癌细胞的细胞周期和凋亡机制的影响。方法用化学合成的靶向Her2/neusiRNA转染肺腺癌calu3细胞,转染前后通过逆转录聚合酶链反应(RTPCR)测定细胞中Her2/neu、细胞周期蛋白(Cyclin)D1mRNA水平;流式细胞术检测Her2/neu蛋白水平和细胞周期的变化;AnnexinⅤ异硫氢酸荧光素(FITC)试剂盒检测肺癌细胞的凋亡情况;荧光分光光度法测定Caspase3活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)技术检测培养液上清中血管内皮生长因子(VEGF)水平。结果Her2/neusiRNA能在mRNA和蛋白水平下调肺癌细胞株calu3中Her2/neu基因的表达。calu3细胞转染Her2/neusiRNA48h后处于G0/G1期的细胞增多,同时S期的细胞比例减少,与未转染对照组、空载体组和非特异性siRNA组比较差异有统计学意义(F=6.1,P<0.01)。转染Her2/neusiRNA后CyclinD1mRNA水平下降,同时培养上清液中的VEGF含量为176pg/ml±6pg/ml(F=24.7,P<0.01),Caspase3活性为135%±4%(F=8.9,P<0.01),细胞凋亡率为25.1%±1.2%(F=10.3,P<0.01)。结论化学合成的靶向Her2/neusiRNA能够下调Her2/neu基因表达,继而降低CyclinD1和VEGF水平,激活Caspase3途径,从而阻滞细胞周期于G0/G1期和诱导凋亡。

高渗盐溶液复苏对重度创伤-失血性休克大鼠小肠屏障功能的影响

目的探讨复方乳酸钠和高渗盐溶液早期复苏对创伤-失血性休克大鼠肠道功能的影响。方法 80只SD大鼠随机分为对照组(A组,8只)、休克组(B组,8只)、复方乳酸钠复苏组(C组,32只)和高渗盐+复方乳酸钠复苏组(D组,32只)。采用分光光度法检测血浆中二胺氧化酶(DAO)活性和D-乳酸浓度,在光镜下观察小肠组织的形态学改变。结果与A组相比,C、D组不同时间点血浆中DAO活性、D-乳酸浓度、小肠黏膜损伤指数均增加(P<0.05),以C组增加更为明显(P<0.05)。与A组相比,复苏3、6h时,C、D组小肠绒毛高度及黏膜厚度减少(P<0.05),且C组减少更为明显(P<0.05)。结论与复方乳酸钠相比,7.5%高渗盐溶液用于早期复苏创伤-失血性休克有用量少、输入快、维持血压时间长等优点,可有效降低肠屏障功能的损伤,并维持大鼠黏膜形态、结构的完整性。