人骨髓间质干细胞作为骨、软骨组织工程种子细胞的实验研究

目的 :探讨经体外扩增、诱导分化的人骨髓间质干细胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells,hMSC)作为组织工程化骨、软骨种子细胞的可行性。方法 :体外分离、培养、扩增hMSC ,以流式细胞仪检测hMSC的表面抗原。诱导hMSC向成骨细胞、软骨细胞分化。以倒置显微镜和电子显微镜观察细胞的形态 ;以组织化学、免疫组织化学和RT PCR ,检测成骨细胞、软骨细胞的特异性标志物。结果 :分离得到的细胞可表达hMSC的特异抗原 ,在体外扩增 15代以上 ,其形态及表面抗原保持不变。成骨诱导培养的细胞上清液中ALP的含量高于对照组 (P <0 .0 5 )。成骨及成软骨诱导的细胞形态均由成纤维样梭形向多边形转变。透射电镜观察可见大量扩张的粗面内质网、高尔基体及线粒体。扫描电镜观察可见经成骨诱导后的细胞表面有钙盐沉积 ,成软骨诱导的细胞表面有胶原样突起。成骨诱导培养后 ,可见碱性磷酸酶 (ALP)染色、Ca结节染色、胶原 Ⅰ (COL Ⅰ )及骨钙素 (osteocalcin ,OC)免疫组化染色阳性 ,同时RT PCR检测COL Ⅰ、OCmRNA表达阳性。成软骨诱导后 ,甲苯胺蓝染色见细胞周围有大量的异染性基质 ,免疫组化和RT PCR检测COL Ⅱ表达阳性。结论 :hMSC在体外可大量扩增。在特定培养液诱导下 ,可向成骨细胞及软骨细胞转化 ,可作为骨。

人骨髓间质干细胞的优化培养

目的 探索人骨髓间质干细胞 (mesenchymal stem cells,MSCs)的优化培养条件。 方法 应用不同条件 ,研究原代培养方法、接种密度、首次换液时间、培养基、血清浓度及种类对细胞生长的影响 ,并以选定的条件培养、扩增 MSCs,扩增后向成骨细胞和软骨细胞诱导。 结果 在其它条件不变的前提下 ,密度梯度分离法优于全骨髓法 ,2 .5× 10 5/ cm2是人 MSCs原代培养的适宜接种密度 ,原代第 5天首次换液为最佳换液时间 ,DMEM培养基优于 α- MEM培养基 ,血清 C为适宜的血清 ,10 %为适宜的血清浓度。所选条件培养的 MSCs可在体外扩增 15代以上 ,形态保持不变 ,并具有良好的分化潜能。 结论 建立了人 MSCs的体外优化培养条件 ,为其在组织工程方面的应用作出了新的探索。

不同浓度藻酸钙复合软骨细胞体外培养的实验研究

为探寻复合软骨细胞生长的最佳藻酸钙浓度,将传代培养的、细胞终浓度为1×107/mL的软骨细胞复合藻酸钠凝胶,然后滴入浓度分别为100、200、300、400、500mmol/L的氯化钙溶液中,固化15min形成藻酸钙凝珠,于体外培养7d后,行HE染色及Masson’s三色染色,结果显示软骨细胞与固化剂氯化钙浓度为100、200、300mmol/L的藻酸钙凝胶复合良好并能在其中保持活性及分裂能力;而在氯化钙浓度为400mmol/L和500mmol/L的藻酸钙凝胶中,软骨细胞的活性及分裂能力明显下降.因此固化剂氯化钙的浓度可以提高到300mmol/L,该浓度不仅对软骨细胞的生长无影响,而且能适当提高藻酸钙凝胶的机械强度,可以作为一种较理想的软骨组织工程支架材料.

丝裂霉素C对粘膜损伤修复作用的实验研究

目的 观察高浓度和长时间接触丝裂霉素C(MitomycinC ,MMC)对创面损伤修复的作用,以期为临床上MMC的合理应用提供依据。方法 将使用同种方法致鼻粘膜损伤的4 0只兔随机分为4组,每组10只。分别为生理氯化钠溶液对照组(A)和3组MMC实验组,B组药物浓度0 .4mg·ml-1、接触时间5min ;C组药物浓度0 .4mg·ml-1、留置;D组浓度2 .0mg·ml-1、接触时间5min。术后1月对各组粘膜愈合情况、病理形态学变化进行观察。结果 A组9例粘连,B组仅有2例粘连发生,B组与A组比较差异具有显著性的意义(P <0 .0 5 )。C组、D组均未有粘连发生。C组有6例鼻中隔穿孔,D组2例。光镜和电镜检查显示:A组成纤维细胞大量增殖,B组、C组、D组的成纤维细胞增殖受到抑制,B组创面修复良好,C组、D组中可见大量坏死细胞,粘膜上皮不连续,D组有结构异常的合胞纤毛和裸纤毛出现。结论 MMC能有效的抑制成纤维细胞增殖,但是高浓度和长时间接触MMC对于创面愈合均有不良影响。应用浓度0 .4mg·ml-1MMC ,接触时间5min对于鼻粘膜修复是安全、简单而有效的。

人骨髓间质干细胞库的初步建立

目的探讨建立生物学性状稳定的人骨髓间质干细胞(humanmarrowmesenchymalstemcells,hMSCs)库的可行性,为组织工程种子细胞的来源作初步探索。方法对分离得到的hMSCs采用液氮低温冻存,并在一定时间复苏培养,以流式细胞仪检测其表面抗原,在诱导培养基中对其行成骨和成软骨诱导培养,光镜、电镜观察细胞的形态,采用组织化学、免疫组织化学及分子生物学的方法检测成骨和成软骨诱导的特异标志物:碱性磷酸酶、型胶原、型胶原及骨钙素,研究其生物学性状。结果从骨髓中分离得到了纯度达96%以上的hMSCs,复苏后的hMSCs形态和表面抗原保持不变,可继续扩增10代以上,倍增时间40h。复苏后第2、6、10代hMSCs均保持较强的向软骨细胞、成骨细胞的分化能力。结论初步建立了hMSCs库,可为骨及软骨组织工程提供较好的种子细胞。

困难条件下的气管切开术

目的:探讨困难条件下气管切开术的方法和经验,以期缩短手术时间,减少并发症,降低死亡率。方法:回顾性总结我科5年来施行的困难条件下气管切开术36例。结果:36例困难条件下的气管切开术全部获得成功,未出现严重并发症及与气管切开术有关的死亡病例。结论:环状软骨弓在绝大多数情况下都可作为气管切开术明显和稳定的参考标志。3度呼吸困难的患者,条件允许时最好先经口或经鼻插管,变紧急气管切开为常规气管切开,能降低手术意外的发生。

豚鼠咽鼓管和肺脏表面活性物质中磷脂成分的比较

目的、方法：用高效液相色谱分析、比较豚鼠咽鼓管和肺表面活性物质中磷脂的组成成分和含量，为人工合成咽鼓管表面活性物质，预防和治疗中耳炎提供理论依据。结果：咽鼓管和肺表面活性物质中均检测出了磷脂酰胆碱（ＰＣ）、磷脂酰肌醇（ＰＩ）、磷脂酰丝氨酸（ＰＳ）、磷脂酸（ＰＡ）、磷脂酰乙醇胺（ＰＥ）、神经鞘磷脂（ＳＰ），每４只咽鼓管中各磷脂含量（ｇ）及所占百分比：ＰＥ：１２３．４６４０．６６，（４２８）％；ＳＰ：６７．９５１７．９４，（２１４）％；ＰＳ：４８．５７土１８．８４，（１６４％）；ＰＣ：３２．６０１３．１７，（１１４）％；ＰＩ：２２．９４５．７３，（８士２）％；ＰＡ：２．９０士０．００，（１０．３）％．而１个肺中：ＰＣ：５６３．８２士７４．５，（６８土４）％；ＰＥ：９５．９２士２０．３０，（１１士２）％；Ｐｌ：６８．３３士１４．６３，（８士１）％；ＰＳ：５１．４３士１４．２６，（６２）％；ＳＰ：３４．０４土６．１３，（４士１）％：ＰＡ：１６．８３ｌ．６１，（２土０）％。结论：咽鼓管表面活性物质中磷腊成分含量不同于肺，提示体内不同部位的表面活性物质可能各有特殊的功能作用。

喉癌组织中TSLC1基因启动子过甲基化及mRNA表达

目的:探讨TSLC1基因启动子区过甲基化与喉癌的关系.方法:采用甲基化特异性PCR和RT-PCR法分析喉部正常粘膜、声带息肉、喉癌细胞Hep-2和喉癌组织中TSLC1基因启动子区过甲基化及其mRNA表达状况.结果:40例喉癌组织中,有21(52.5%)例TSLC1基因启动子区过甲基化,其在各病理分级、临床分期和分型之间差异无统计学意义(P>0.05),而在N分级(N0和N1)之间差异有统计学意义(P<0.05).喉癌细胞Hep-2也显示TSLC1基因启动子区过甲基化.RT-PCR结果显示,TSLC1 mRNA在所有甲基化的喉癌组织和喉癌细胞Hep-2中均无表达,而喉部正常组织,声带息肉组织和非甲基化的喉癌组织中均有表达.结论:喉癌组织中TSLC1基因启动子区过甲基化与其mRNA失表达有关,可能是喉癌发生、发展的原因之一,可作为喉癌诊断和预后分析的检测指标.

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增.用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用.结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显.结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.

HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究

目的 研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法 构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。结果 Hep 2 /tk细胞与未转染tk基因的Hep 2 /0、Hep 2细胞相比较 ,三者的生长速度无明显差别。Hep 2 /tk细胞对GCV高度敏感 ,即低浓度GCV(0～ 1mg/L)处理Hep 2 /tk细胞 7d,可将其大部分细胞杀死 ,增加GCV的浓度 (>1mg/L)不能显著增强其对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。 结论 人喉癌细胞Hep 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 。

Hsv-tk、重组人IL-2、TNF-α融合基因表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有Hsvtk、重组人IL2rhIL2、TNFαrhTNFα不同组合融合基因的逆转录病毒表达载体。方法:经分离人外周血单个核细胞peripheralbloodmononuclearcellPBMC总RNA,以反转录聚合酶链反应reversetranscriptionpolymerasechainreactionRTPCR制备人IL2互补DNAcomplementaryDNAcDNA模板。分别以PCR方法扩增3种基因,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆经鉴定后测序。将测序正确的各目的基因分别从测序载体相应酶切位点消化后,回收并纯化后与经相同双酶消化后的线性化PLXSN表达载体连接,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经筛选后随机挑取阳性菌落后,提取质粒酶切鉴定插入片段大小和位置以获得正确重组子。按上述定向克隆方法依次将各片段正向插入至PLXSN表达载体的多克隆位点间,以构建含不同融合基因的真核表达载体。结果:经限制性酶切分析及PCR方法鉴定,各插入基因及融合基因大小、位置、方向均正确无误。结论:Hsvtk、IL2、TNFα不同组合融合基因表达载体的成功构建为喉癌的基因治疗提供部分实验基础也为表达具有多功能活性的新型融合蛋白和发现细胞因子的新功能提供有利条件。

Hsv-tk、重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的 :构建 pEGFP -TK -rhTNF -α表达载体 ,观察其在喉癌细胞Hep - 2中的瞬时表达。方法 :应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体 pGEM -T -Easy测序 ,利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK -rhTNF -α并将其亚克隆至pEGFP -N3的EcoRI和BamHI位点间 ,成功构建表达载体 pEGFP -TK -rhTNF -α ,并在该载体转染人喉癌细胞Hep - 2后观察融合蛋白表达情况。结果 :酶切鉴定证实TK -rhTNF -α融合基因片段已克隆到pEGFP -N3的EcoRI和BamHI位点间 ,并在转染人喉癌细胞Hep - 2中观察到TK -rhTNF -α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论 :pEGFP -TK -rhTNF -α表达载体便于观察转染细胞中TK -rhTNF -α融合蛋白的表达情况及蛋白定位 。

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的表达载体的构建

目的:构建人端粒酶催化亚基(humantelomerase reversetranscriptase,hTERT)基因的核心启动子调控的荧光素酶报告载体,检测其在肿瘤细胞及正常细胞中表达的差异。方法:提取人HeLa细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因的核心启动子。将其插入荧光素酶报告载体中,经SacI和HindIII酶切和PCR鉴定后,转染肿瘤细胞及正常细胞,观察两种细胞中荧光素酶基因表达的差异。结果:hTERT基因的启动子调控的表达载体在肿瘤细胞中呈高效表达;而在正常细胞中的表达极低。结论:hTERT基因的启动子具有肿瘤特异性,有可能解决肿瘤基因治疗中的靶向性问题。

多孔壳聚糖可降解材料的制备与生物相容性实验研究

目的: 制备多孔可降解壳聚糖材料并观察其生物相容性。方法:将壳聚糖溶于醋酸中制成1％壳聚糖醋酸溶液,加胎牛血清与0.25％戊二醛溶液搅拌,冷冻后减压干燥。取一片材料做扫描电镜观察。测量孔径大小并做图像分析,计算孔隙率。取6片埋入3只大白兔皮下,于4、6、8周后取材作常规石腊切片,HE染色,光镜观察。结果:材料表面呈多孔结构,孔径为40-130μm,孔隙率为85％。术后4周时可见材料周围有少量炎性细胞浸润,孔隙内有纤维结缔组织长人。6周和8周时包绕的纤维组织变得致密,炎性细胞减少,无材料排出现象。结论:本材料具有良好的生物相容性和多孔结构,是可供选择的组织工程材料之一。

单个电极接触不良对腹部电阻抗断层成像的影响

目的:研究单个电极接触不良和电阻抗断层成像之间的关系,以便为长期监护提供必要的理论和现实依据.方法:采用电阻抗成像监护仪对14人采用16电极法进行监护,对比电极接触良好和其中某一个电极接触不良时监护图像的差别.结果:发现某一电极接触不良,则对应它的那一部分图像的灰度会发生明显的变化,而图像其他部分的灰度则变化很小.结论:得出了单个电极接触不良对成像的影响的规律,对长期监护中电极接触不良问题的监测提供了依据.

EB病毒和人乳头状瘤病毒感染与鼻、鼻窦内翻性乳头状瘤的关系

目的:探讨鼻、鼻窦内翻性乳头状瘤中人乳头状瘤病毒(HPV)和EB病毒的感染率及临床意义。方法:用聚合酶链反应(PCR)方法检测30例有随访记录的鼻、鼻窦内翻性乳头状瘤及恶变的石蜡包埋组织标本中的人乳头状瘤病毒和EB病毒基因。结果:30例中检出HPV20例(66.7％),EB病毒12例(40％),其中9例乳头状瘤恶变组织中检出HPV单独感染4例(全部为HPV_(16)型),EB病毒单独感染4例,两者混合感染1例,即9例乳头状瘤恶变组织中100％存在肿瘤病毒感染;10例鼻息肉中则未检出HPV和EB病毒。EB病毒感染与鼻、鼻窦内翻性乳头状瘤的复发具有相关性。结论:鼻、鼻窦内翻性乳头状瘤不仅与HPV感染有关,可能与EB病毒也有关;HPV_(16)与内翻性乳头状瘤癌变有关,EBV与复发有一定相关。

自体软骨移植与气管重建

背景:临床上经常遇到长距离、大范围的气管狭窄或缺损需气道重建。目的:观察动物自体软骨移植在喉气管重建中的应用效果。方法:切除新西兰兔环状软骨及部分气管前壁,制造喉气管损伤,取自体肋软骨膜移植修复,移植后8-24周处死存活动物,观察修复情况。结果与结论:大体观察:动物呼吸通畅,饮食正常,植入软骨膜与周边组织结合紧密,创口愈合良好,无肉芽组织及瘢痕形成,管腔内表面光滑且有黏膜覆盖。光镜结果显示:创口处有黏膜生成,外层有纤维细胞及横纹肌细胞,少量新生软骨形成,软骨细胞与肌细胞链接紧密。结果提示,自体软骨移植可以应用于动物喉气管重建,且具有很好的效果。

鼻及鼻窦内翻性乳头状瘤临床表现和人乳头状瘤病毒基因分析研究

目的:回顾分析鼻及鼻窦内翻性乳头状瘤治疗经验和研究人乳头状瘤病毒基因(HPVDNA)与乳头状瘤预后关系。方法:总结我院15年来30例鼻及鼻窦内翻性乳头状瘤的临床资料。用PCR方法检测其中21例石蜡包埋组织中HPVDNA。结果:30例鼻及鼻窦内翻性乳头状瘤中11例(36.6%)为复发性乳头状瘤,9例(30%)乳头状瘤癌变,全部采用手术治疗,癌变者配合放疗,随访1～3年11例未见复发,2例复发后再次手术,3例术后3个月至2年复发后癌变。3例癌变3年仍存活,2例全身转移死亡。21例HPVDNA阳性15例,其中HPV16阳性6例,癌变中HPV阳性5例,全部HPV16型,3例复发癌变者癌变前后HPV16皆为阳性。结论:鼻及鼻窦内翻性乳头状瘤应彻底手术切除以减少复发及癌变。HPV感染与鼻及鼻窦乳头状瘤发病有关,HPV16与恶性转化有密切关系。

低温冻存同种异体软骨细胞在喉功能重建中的应用

目的:通过对深低温冻存的软骨细胞作为种子细胞构建组织工程化软骨修复喉软骨缺损的能力研究,寻找一种活性软骨细胞的保存方法。方法:取3周龄新西兰兔关节软骨,经深低温冻存,复苏冻存不同时间的软骨细胞,体外培养,培养细胞呈单层细胞铺满培养瓶底后收集细胞,制成细胞悬液,接种于聚羟基乙酸(polyglycolicacid,PGA)三维支架材料上,复合物体外培养1周,接种于同种异体兔甲状软骨缺损处,术后2,4,8周取材,行大体及组织学观察。结果:经深低温冻存的软骨细胞与新鲜软骨细胞修复区愈合良好,无瘢痕及坏死现象,组织学观察均有软骨生成及基质分泌;冻存不同时间的软骨细胞组之间无明显差异。结论:经深低温冻存的软骨细胞保持了分裂增殖及合成基质的能力,可用于组织工程修复软骨缺损,冻存时间对其功能无明显的影响。