膜周蛋白PICK1促进细胞膜上P2Y6受体表达及小胶质细胞的吞噬功能

膜周蛋白PICK1(protein interacting C-kinase-1)参与多种膜受体与膜上蛋白的运输并影响细胞的功能。本研究旨在探索小胶质细胞PICK1与P2Y6受体之间的相互作用是否可改变P2Y6受体在细胞膜上的表达,以及对小胶质细胞吞噬功能的影响。采用小鼠脑内皮层原代培养的小胶质细胞进行免疫共沉淀实验揭示,与PICK1敲除小鼠比较,野生小鼠皮层小胶质细胞内存在PICK1-P2Y6受体相互作用。生物素化、密度梯度离心结合蛋白质印迹实验证明,PICK1基因敲除小鼠的小胶质细胞膜表面P2Y6受体表达水平降低。荧光胶珠吞噬实验结合免疫组织化学染色显示,PICK1基因敲除小鼠的小胶质细胞对UDP(刺激)引起的荧光胶珠吞噬作用减弱。蛋白质印迹实验显示,与野生型小鼠比较,PICK1基因敲除小鼠小胶质细胞中的Akt-308T磷酸化水平明显降低;使用Akt抑制剂API-2能有效抑制Akt在小胶质细胞内的(磷酸化)激活及UDP刺激引起的吞噬作用。上述结果表明,敲除PICK1能下调小胶质细胞膜上P2Y6受体的表达,并降低小胶质细胞的吞噬功能,且这一过程依赖Akt磷酸化修饰。总之,PICK1可促进P2Y6受体在细胞膜上的表达,是小胶质细胞吞噬功能的重要调节子;敲除PICK1可下调P2Y6膜受体表达,并降低小胶质细胞的吞噬功能。这一结果可加深对小胶质细胞的吞噬功能及机制的认识。

STAT3信号分子在创伤弧菌侵入树突状细胞中的作用

目的研究创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)侵入小鼠树突状细胞株(dendritic cell,DC)时,树突状细胞凋亡率变化与STAT3的表达,探讨STAT3信号分子在创伤弧菌侵入树突状细胞中的作用。方法建立创伤弧菌(Vv1.1758株)与小鼠树突状细胞(DC 2.4株)混合培养模型,采用FITC-Annexin V/PI、RT-PCR法和免疫荧光法分别检测不同混合培养时间段,树突状细胞凋亡率、STAT3 mRNA的表达和p-STAT3蛋白表达量的变化。结果创伤弧菌Vv 1.1758株与DC2.4混合培养2 h后,细菌即可侵入DC2.4,细菌侵入率明显升高(P<0.05);混合培养2 h,4 h,6 h后,细胞凋亡率分别为(38.3±8.7)%,(58.4±10.8)%和(69.1±13.5)%;混合培养2 h后,STAT3 mRNA相对表达量开始下降,p-STAT3蛋白表达水平呈显著下降趋势,STAT3出现胞核内转移现象。结论创伤弧菌可降低树突状细胞内STAT3 mRNA的表达量,抑制胞内p-STAT3蛋白的表达,从而诱导树突状细胞凋亡,可能是创伤弧菌的重要致病机制之一。

芍药苷通过抑制脊髓Akt-NF-kB信号通路及小胶质细胞激活缓解炎症性疼痛

芍药苷具有抑制炎症和镇痛的作用,在治疗炎症疼痛方面具有重要价值,但其作用机制尚不明确。本研究发现,弗氏完全佐剂诱导小鼠炎症疼痛模型,用80 mg/kg芍药苷腹腔注射能有效缓解疼痛。检测发现芍药苷治疗后,小鼠机械性痛阈与热板痛阈均明显升高(机械性痛阈值:由6.38±1.00 g提高至8.31±0.81 g;热板痛阈值:由5.78±0.76 s提高至9.90±1.58 s);同时抑制外周炎症因子TNF-α等的释放(由708.71±46.55 pg/m L降低至588.65±16.02 pg/m L);免疫组织化学检测发现,芍药苷能有效抑制脊髓背角小胶质细胞的激活;NO检测结果发现,脊髓部位NO合成降低(3.55±0.28μmol/L·g-1Pro降至2.25±0.71μmol/L·g-1Pro);Western印迹检测证实,脊髓部位i NOS在使用芍药苷后,表达恢复正常水平。同时发现,Akt-NF-κB信号可能参与芍药苷的镇痛作用。上述结果提示,芍药苷缓解慢性炎症疼痛可通过抑制炎症因子释放,也通过抑制脊髓小胶质细胞的激活,而此过程依赖抑制Akt-NF-κB信号的激活。

芍药苷通过IL-10-STAT3信号通路抑制脂多糖诱导BV2细胞炎症与吞噬作用

小胶质细胞是中枢神经系统中重要免疫细胞,也是炎症反应中的主要效应细胞。芍药苷被证实能有效抑制炎症反应,在调节免疫方面具有巨大药用价值。本文旨在阐明BV2细胞炎症反应中芍药苷对细胞炎症及吞噬的抑制作用,并探索其中潜在机制。体外实验利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导BV2细胞发生炎症反应,芍药苷能有效抑制BV2细胞TNF-α和NO的产生以及BV2细胞异常增加的吞噬功能,并且在此过程中IL-10-STAT3信号通路被激活;芍药苷的抑制作用在我们使用STAT3抑制剂JSI-124后显著降低,TNF-α和NO的表达量增加、BV2细胞的吞噬功能增强。上述结果表明,芍药苷能有效抑制BV2细胞炎症作用及吞噬作用,这一过程中依赖IL-10-STAT3信号通路的激活。这将加深我们对芍药苷抑制小胶质细胞炎症作用机制的认识。

钙离子及信号转导和转录激活因子3信号分子在创伤弧菌临床分离株 B2侵入树突状细胞中的作用

目的：探讨创伤弧菌临床分离株 B2侵入树突状细胞（DC）过程中细胞内钙离子[Ca2＋]i浓度的改变以及信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号分子的作用。方法建立创伤弧菌 B2株与DC 2．4细胞的混合培养模型，流式细胞术检测不同侵入时间段内细胞凋亡率和坏死率，荧光探针 Fluo-8-AM 观察[Ca2＋]i 的改变，Western 印迹和免疫荧光技术检测 STAT3和磷酸化 STAT3（p-STAT3，705位点）相对分子表达量和细胞内分布。数据分析采用 t 检验。结果创伤弧菌 B2株与 DC 2．4细胞混合培养1、2、3和4 h 后，其细胞凋亡率分别为（13．10±4．72）％、（30．10±3．52）％、（46．20±15．61）％和（31．00±19．10）％，创伤弧菌1．1758株与创伤弧菌 B2株细胞凋亡率比较差异有统计学意义（t 值分别为4．30、22．33、4．30和4．30，P 值分别为0．040、0．002、0．040和0．040）；同时细胞坏死率分别为（19．70±3．50）％、（39．20±4．60）％、（40．90±13．80）％和（62．10±8．20）％，创伤弧菌1．1758株与创伤弧菌 B2株细胞坏死率比较差异有统计学意义（t 值分别为9．93、14．09、4．30和14．09，P 值分别为0．010、0．005、0．049和0．005）。与创伤弧菌1．1758株相比，创伤弧菌 B2株能在相同时间内引起更为明显的细胞凋亡和坏死。荧光显微镜下观察到[Ca2＋]i 的荧光强度随着细胞凋亡的增加而增强。STAT3分子的总蛋白量有所增加，但 p-STAT3（705位点）相对分子表达量则呈下降趋势，与对照组相比 p-STAT3（705位点）分子在细胞内的分布未见明显改变。结论创伤弧菌 B2株在侵入 DC 过程中，升高[Ca2＋]i 的同时抑制 STAT3（705位点）磷酸化，有可能是创伤弧菌 B2株诱导细胞快速凋亡和坏死的重要机制。

线粒体损伤在槲皮素诱导人乳腺癌MCF-7细胞中的作用

目的探讨槲皮素(quercetin)诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡过程中,线粒体损伤作用及其可能机制。方法建立槲皮素(80.0μmol·L^(-1))诱导MCF-7细胞凋亡模型。采用透射电镜观察槲皮素诱导MCF-7细胞凋亡过程中线粒体病变情况。荧光探针DCFH-DA、Fluo-8/AM检测槲皮素处理的MCF-7细胞内活性氧(ROS)、Ca^(2+)离子水平。采用胞外Ca^(2+)螯合剂胞(1mmol·L^(-1)EGTA)和胞内Ca^(2+)阻断剂(1 nmol·L^(-1)ryanodine)进行阻断试验,流式细胞术检测阻断前、后细胞凋亡情况。采用Western blot检测细胞浆、线粒体细胞色素C(Cyt C)的表达。结果槲皮素可诱导MCF-7细胞线粒体损伤,呈现球形肿胀、线粒体嵴消失、大量空泡形成。细胞内ROS、Ca^(2+)水平升高。胞内钙离子阻断剂ryanodine可抑制槲皮素的细胞凋亡作用,细胞凋亡率分别下降55.4%(24 h),30.0%(48 h)和39.9%(72 h),胞外钙离子螯合剂EGTA则无抑制作用。处理24,48和72 h的MCF-7细胞,胞浆内Cyt C表达升高,线粒体Cyt C表达变化不大。结论线粒体损伤在槲皮素诱导MCF-7细胞凋亡中起重要作用,其机制可能与胞内ROS的升高,胞浆内Ca^(2+)和Cyt C释放有关。