四川省腹泻病猪的猪萨佩罗病毒检测及1B基因序列比较分析

为了解猪萨佩罗病毒（porcine sapelovirus,PSV）的流行及变异情况,采集2015-2016年四川地区12个县市34个猪场共计428份腹泻病料,采用QRT-PCR方法对PSV进行检测。结果显示：在428份病料中,共有114份为PSV阳性,阳性率为26.6%;所检测的34个猪场中,共有20个猪场显示PSV阳性,猪场阳性率为58.8%,表明PSV在四川地区普遍存在。此外,对来自不同县市共14份PSV阳性病料1B全基因进行PCR扩增,通过分子克隆,测序,再利用序列分析软件对四川部分地区猪萨佩罗病毒1B基因进行序列分析。结果表明,14条猪萨佩罗病毒1B基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列相似性分别为90.6%~100%和97.1%~100%。遗传进化分析显示,该研究获得的四川株与已知中国株分属于一个大的分支,说明我国猪萨佩罗病毒1B基因序列较为保守,没有发生大的基因变异。所有中国分离株与韩国株、德国株、英国株处在不同分支,又说明我国PSV的流行毒株可能存在独立进化。

四川地区腹泻仔猪群猪圆环病毒Ⅱ型分子流行病学调查

为了解四川地区腹泻仔猪群中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染情况,本实验采用PCR方法对病料样品进行PCV2检测,并对分离的病毒DNA进行测序及生物信息学分析。结果显示PCV2感染率为71.6%(312/436),阳性结果中肠系膜淋巴结检出率为100%(312/312)。将扩增并测序的19条PCV2序列与Gene Bank中23株参考序列比较分析,构建了系统进化树,结果表明四川省腹泻仔猪群感染PCV2基因型主要为PCV2b、PCV2d基因型。针对PCV2高频突变ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析,结果显示主要抗原表位氨基酸位点存在替换,进而引起抗原漂移,这可能促使PCV2免疫原性发生改变。本研究为四川地区PCV2的防制奠定了基础。

四川宜宾七种中药提取物体外抗菌活性研究

用肉汤二倍稀释法和琼脂平板培养计数法,研究四川宜宾七种中药的提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的体外抑制作用.结果表明：黄柏提取物的抗菌活性最强,最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）为15．6～125 mg＆#183;mL-1,最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration,MBC）为31．25～250 mg＆#183;mL-1；栀子提取物抗菌活性次之,MIC 为62．5～125 mg＆#183;mL-1,MBC 为125～＞250 mg＆#183;mL-1；佛手提取物有较稳定的抗菌活性,MIC均为125 mg＆#183;mL-1,MBC为125 mg＆#183;mL-1和250 mg＆#183;mL-1；姜黄、杜仲、何首乌、细毡毛忍冬的提取物抗菌活性相对较差,大部分 MIC≥250 mg＆#183;mL-1.说明四川宜宾的黄柏和栀子的提取物抗菌活性较强,佛手提取物抗菌活性较稳定,有进一步研究的价值.

四川某些规模化猪场大肠杆菌的分离鉴定及耐药性监测

为有效监测四川某地区猪致病性大肠杆菌的耐药性,本试验采用纸片扩散法对采自该地区不同区域的8个猪场的70株致病性大肠杆菌进行药物敏感性测定,结果表明,分离菌对12种药物存在不同程度的耐药性:对阿莫西林、红霉素高度耐药,耐药率分别为100%、82.86%,敏感性最高的氧氟沙星、头孢唑啉敏感率分别为82.86%、60%,所有菌株耐药性至少3耐,最高达11耐,51.43%呈7耐以上,共39种耐药谱型。由此可见,该地区规模化猪场大肠杆菌耐药程度严重。故筛选有效抗生素,采取必要措施防治此病已势在必行。

猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析

分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。

四川某规模化猪场仔猪腹泻病的诊疗体会

采用RT PCR方法,从四川某规模化猪场仔猪腹泻死亡病例病料中检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒,并分离细菌,最终鉴定为猪传染性胃肠炎继发大肠杆菌感染。药敏试验结果显示,分离的致病性大肠杆菌对林可霉素和氧氟沙星高度敏感。根据结果制定相应防治措施,经治疗处理后,病情得到有效控制。

四川彭州地区养殖虹鳟传染性造血器官坏死病病毒的分离、鉴定及病理学观察

近期,四川省成都彭州市某虹鳟养殖场暴发流行疾病,导致养殖虹鳟死亡率高达 90%。现场采样观察发现患病鱼主要症状为背部发黑,鳔壁、腹膜严重出血,心包积 液,空肠、空胃和显著肠炎。同时对病鱼进行细菌学与组织病理学检测,细菌学检查结 果为阴性,病理学观察发现脾脏有典型凝固性坏死,肝脏组织广泛变性、坏死,肠道黏 膜下层水肿,肠上皮充血及上皮细胞脱落坏死,脑膜和心外膜水肿。将病鱼的脾组织研 磨过滤除菌后,腹腔注射60尾健康虹鳟,注射组均表现为急性死亡(累计死亡率达 85%),试验鱼出现与自然发病鱼相同的症状而对照组无异常。取病鱼的脾脏组织研磨过 滤后接种胖头鲤细胞(fathead minnow cell,FHM),细胞感染3 d后出现典型的细胞病变效 应(CPE)。针对编码IHNV糖蛋白(Glycoprotein,G)基因进行逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)检测显示,患病鱼、人工感染病鱼和病变细胞均为IHNV阳性,扩增序列与IHNV糖 蛋白基因同源性为98.2%。对该病毒分离株的G基因进行系统发育分析,结果显示,该分 离株与亚洲分离株聚为一簇,属于JRt基因型。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒四川变异株致病性分析

为探究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)四川变异株SC2012和SC2012-2人工感染仔猪的病理学特征及其在组织内的分布情况,本研究将HP-PRRSV SC2012和SC2012-2株接种健康断奶仔猪,观察不同发病阶段仔猪的临床症状;感染后第14 d剖检仔猪观察其器官病变情况、组织切片的病理学变化,通过免疫组化方法(IHC)和RT-PCR方法检测PRRSV在组织中的分布情况。结果显示,两组仔猪感染后均未出现显著的呼吸症状,并于感染后3 d^5 d出现轻微腹泻;体温测定结果显示,两组仔猪均出现轻度发热、病毒血症,但SC2012-2组较SC2012组仔猪出现时间提前、病毒滴度高、维持时间长;两组仔猪均能够通过唾液、粪便、鼻分泌物排毒;剖检仔猪肺脏均出现不同程度的间质性肺炎,肝脏表现为肝淤血,其它多个器官均有不同程度的炎性细胞浸润;临床症状和病理损伤等结果表明,SC2012较SC2012-2株毒力弱。组织内病毒分布结果显示,两株病毒均在多个器官中分布,但结合组织病理变化分析显示病毒的分布并不一定导致组织损伤,HP-PRRSV四川变异株的突变对其毒力产生了一定的影响。本研究为进一步对HP-PRRSV SC2012和SC2012-2的研究提供必需参数。

四川地区一株猪塞内加谷病毒的分离鉴定及VP1基因的序列分析

猪塞内加谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)是一种新出现的小RNA病毒科病毒,感染该病毒的猪群,尤其是仔猪可能出现严重的病理症状甚至死亡。2015年之前,该病毒主要流行于美国、加拿大及巴西等地区,并于2015年3月传入中国[1],给养猪业带来了严重的经济损失。2018年2月,本实验室检测并收集了阳性病料,采用PK-15细胞对病料进行病毒分离,并通过观察细胞CPE(细胞病变效应)、RT-PCR扩增和VP1基因序列测定进行鉴定。结果显示,成功分离到四川地区第一株SVV并将其命名为CH-MS-2018。对VP1基因的扩增测序及序列分析结果表明,本次分离得到的CH-MS-2018株VP1基因与GenBank上分别于2015年分离的2株和2016年分离的3株美国株的亲缘关系较近,同源性为98.6%。而与最早分离的SVV原始株关系较远,仅为88.0%~89.8%。本研究结果为进一步探索四川地区SVV的生物学性质奠定了基础。

四川地区猪源致病性大肠埃希菌分子分群、生物被膜形成能力及耐药性研究

为了解四川地区猪源致病性大肠埃希菌分子流行特点及流行趋势,本研究在2016—2018年,从四川省各个地区无菌采集患病猪肝脏、脾脏、肺脏、肠道等组织样品208份。通过细菌分离鉴定方法筛选出87株大肠埃希菌,通过小鼠攻毒试验确定其中22株为致病性大肠埃希菌,并对其进行分子分群、生物被膜形成能力检测、耐药性试验、耐药基因及HPI毒力基因检测。结果显示,22株致病性大肠埃希菌多分布于A群(59.09%),且生物被膜形成阳性率为72.73%,其中强成膜能力菌株占40.91%。大肠埃希菌对19种抗生素药物均有不同程度的耐药性,其中对恩诺沙星、复方新诺明、氨苄西林、阿莫西林、红霉素、四环素等9种药物的耐药率较高,为81.82%~100%;对庆大霉素、左氧氟沙星、诺氟沙星、头孢曲松等4种药物的耐药率为63.64%~72.73%;对其他药物的耐药率为4.55%~54.55%,均呈现多重耐药。22株致病性大肠埃希菌检出的耐药基因包括β-内酰胺类TEM(36.36%)、SHV(9.09%)、OXA(9.09%),磺胺类sulⅠ(63.64%)、sulⅡ(95.45%),氨基糖苷类acc(3)-Ⅱ(68.18%)、aph(3′)-Ⅱ(50.00%),氯霉素类cmlA(45.45%)、floR(81.82%),四环素类tetA(81.82%)、tetB(86.36%),喹诺酮类qurB(40.91%)共12个基因型,检测出HPI毒力基因irp1(40.91%)、irp2(13.64%)、fyuA(13.64%)3种。研究结果表明,四川省猪源致病性大肠埃希菌多分布于A群,生物被膜形成阳性率较高,存在严重的多重耐药性,四环素类、氯霉素类、氨基糖苷类及磺胺类耐药基因的携带率较高,且存在多重耐药基因与毒力基因共存情况。研究结果可为四川地区猪病的预防和治疗提供参考依据。

J亚群禽白血病病毒四川株SCMS1的分离及其囊膜基因序列分析

为研究四川首例分离株SCMS1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜(env)基因是否产生新的变异,本实验通过将病毒接种鸡胚成纤维细胞、RT-PCR及PCR检测技术,对包括env基因和部分3'UTR在内的片段进行PCR扩增、克隆和序列测定。结果发现该病毒gp85基因出现6个碱基的缺失,与HPRS-103原型株6995位～7242位对应的核酸序列也发生248个碱基的缺失,包括整个rTM区域。这些碱基的缺失在病毒致病性变化中可能具有潜在的意义。

两株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析

从四川省两个不同肉鸽养殖场的送检病鸽中分别分离出2株鸽源新城疫病毒(NDV),分别命名为Mianyang12505和sms12。致病性试验表明2株鸽源NDV均为弱毒,但融合蛋白(F)基因序列分析表明2个毒株均含有典型的强毒株F蛋白裂解位点112RRQKRF117;以F基因序列为基础构建遗传发育树,发现2株鸽源NDV属于基因Ⅵ型;F基因突变分析表明,鸽源NDVF基因突变率较大,且基因Ⅵ型和Ⅶ型存在规律突变;核酸和氨基酸序列同源性分析表明,国内鸽源NDV毒株核酸序列同源性为83.5%～99.7%,氨基酸同源性为85.6%～100%,且本研究分离的毒株与JS0722Pi同源性最高。

动物细小病毒新型疫苗研究进展

细小病毒是动物病毒中最小最简单的一类单链线状DNA病毒,其在自然界的宿主范围广,感染后呈长期隐性感染,对畜牧养殖业有重要影响。目前,对细小病毒的防治仍以接种减毒疫苗和灭活疫苗为主,但它们仍存在一些不足,如:灭活疫苗成本高;减毒疫苗存在返强的可能性。因此,研制更安全、高效、制备方便的新型疫苗是未来研究的趋势。本文介绍了新型疫苗的发展概况以及近年来细小病毒新型疫苗的研究进展,以期为细小病毒新型疫苗的研究及应用提供参考。

胸腺肽的免疫调节活性及其在病毒性疾病中的应用

胸腺肽是一类胸腺分泌的天然活性多肽,具有广泛的免疫调节活性,其中Tα1、ProTα和Tβ是胸腺肽中的主要成分。目前主要通过化学合成法制取胸腺肽,基于基因工程技术的原核表达法有望解决现有方法总收率低、成本高的缺点。大量研究表明,胸腺肽的主要成分能够有效增强机体免疫细胞的数量与活性,促进抗原呈递,诱导抗病毒因子分泌,调节机体免疫平衡等,还具有疫苗佐剂的潜力。近年来,胸腺肽类药物已用于新冠感染、获得性免疫缺陷综合征等免疫抑制性疾病的治疗,并开始推广至兽医领域的猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等常见动物疾病的预防和治疗。本文对胸腺肽的免疫调节活性、抗病毒的作用机制进行综述,并进一步总结了胸腺肽在病毒性疾病中的应用现状和发展前景,以期为后续研究和应用提供参考。

Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP 60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3895和1752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带;IFA观察结果显示,感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的TCID_(50)为10^(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP 60基因的重组腺病毒,并成功表达了RHDV2 VP60蛋白,为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。

α疱疹病毒囊膜糖蛋白gI影响病毒毒力的分子机制

α疱疹病毒囊膜糖蛋白gI由非必需基因US7编码,在病毒的致病机制中扮演着重要角色。目前研究表明囊膜糖蛋白gI可分别通过参与二次囊膜包被、促进胞间传播在α疱疹病毒粒子组装和扩散过程中发挥重要作用;该蛋白还可以从促进病毒在神经元的轴突转运以及抵抗机体免疫应答等方面影响病毒的毒力。本文对囊膜糖蛋白gI影响α疱疹病毒毒力的分子机制进行总结,为深入研究此蛋白的功能、阐述疱疹病毒的致病机理及疾病防控提供参考。

斑点叉尾源维氏气单胞菌对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因的检测

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）为气单胞菌属（Aeromonas）的一种,亦被称为维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌和维隆气单胞菌,存在于水体和淤泥等环境中[1],能够感染斑点叉尾（Ictalurus punctatus）[2,3]、锦鲤（Cyprinus carpio L.）[4]、西伯利亚鲟（Acipenser baerii）[5]、鲱形白鲑（Coregonus clupeaformis）[6]、华鲮（Sinilabeo rendahl）[7]、框镜鲤（Cyprinus carpio）[8]等多种鱼类。其中,斑点叉尾感染维氏气单胞菌近几年才被发现,其发病率可达30%以上,病鱼死亡率在50%以上,给养殖户造成了巨大的经济损失,也严重制约了斑点叉尾养殖业的健康发展[2,9]。

竹鼠肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

报告四川省竹鼠养殖过程中致病性细菌的检测及生物学特征。通过对发病濒死竹鼠病变组织进行细菌学检查及分离,对分离得到的一株优势菌进行形态特征、理化性质和16SrDNA序列的分子鉴定,人工感染及药敏试验,判定为肺炎克雷伯氏菌。该菌对供试的小白鼠有致病性,对供试的头孢美唑等药物高度敏感,对丁胺卡那霉素等中度敏感,对洁霉素等耐药。推断此株肺炎克雷伯氏菌是导致竹鼠死亡的主要病原菌。

1株亚硝酸盐降解菌的筛选、鉴定、降解条件及效果

从养殖水体中筛选出1株对亚硝酸盐具有高效降解能力、增殖速度快、稳定和安全的优良菌株,经细菌学常规检测和16SrRNA序列分析确定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),并命名为SZ-3。对SZ-3菌株降解条件的单因素实验发现,其最佳降解条件是:pH7.0,温度33℃,降解所需的最低葡萄糖含量为0.01mg/L,在24h内对亚硝酸盐的降解率达69.58%。在亚硝酸盐质量浓度为5mg/L的100L污染水体养殖实验中,添加1000mL含量为1×108CFU/mL的SZ-3培养菌液离心后的纯菌体,在28℃的水温条件下经96h,SZ-3菌株对亚硝酸盐的降解率可达91.78%。表明该菌株对污染水体中的亚硝酸盐具有较强的降解效果。本研究旨在为研发高效实用的降解亚硝酸盐微生态活性菌奠定基础。

投喂高脂饲料后草鱼主要生化指标和乙酰辅酶A羧化酶1 mRNA表达的变化

为了研究草鱼肝脏对高脂饲料的代谢调控机理,试验研究了连续12周投喂含8.1%脂肪的饲料对草鱼血清生化指标、肝胰脏生化指标及乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)mRNA表达的影响。将120尾平均体重为(15.0±2.4)g的健康草鱼随机为高脂组和基础组,分别投喂含8.1%脂肪的高脂饲料和4.6%脂肪的基础饲料,并在试验的第4、8、12周检测草鱼血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性以及肝胰脏中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。在试验第12周,制作病理切片观察肝胰脏组织形态,并应用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝胰脏ACC1 mRNA的相对表达量。结果表明:试验期间,高脂组草鱼肝细胞出现损伤,并随投喂时间的延长而加重;高脂组草鱼血清中AST、ALT活性及TG、CHO含量以及肝胰脏中MDA含量均随投喂时间的延长而显著或极显著上升(P<0.05或P<0.01),而肝胰脏中SOD和CAT活性则随投喂时间的延长而显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01)。在试验第12周,高脂组草鱼血清中AST、ALT活性及TG、CHO含量以及肝胰脏中MDA含量均显著或极显著高于基础组(P<0.05或P<0.01),而肝胰脏中SOD和CAT活性则显著或极显著低于基础组(P<0.05或P<0.01);与基础组相比,高脂组草鱼肝胰脏ACC1 mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)。由此得出,高脂饲料的连续投喂升高了草鱼的血脂水平,并使草鱼肝胰脏出现损伤,其作用机制可能与高脂饲料降低草鱼抗氧化能力以及促进肝脏脂肪合成有关。