携带猪传染性胃肠炎病毒S/N融合双基因的减毒沙门氏菌的构建与鉴定

旨在构建携带猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S/N融合双基因的减毒沙门氏菌,并鉴定该疫苗菌株的生物学特性,为开展TGEV口服免疫研究奠定材料基础。采用PCR方法从克隆质粒19T-S和19T-N中分别扩增了TGEV的S基因(含主要抗原位点,2.1kb)和N基因(1.2kb),将S基因和N基因插入pVAX1载体,构建携带S/N融合双基因的真核表达质粒pVAX-S/N。将pVAX-S/N电转化减毒沙门氏菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAX-S/N),并对重组菌株SL7207(pVAX-S/N)的体外稳定性、目的基因在体内的转录、口服接种小鼠的安全性及在体内稳定性等特性进行了鉴定。结果表明,真核质粒pVAX-S/N构建成功,该质粒转染COS7中能表达2个目的蛋白,重组菌SL7207(pVAX-S/N)在Kan+抗性下体外培养稳定性好,口服接种小鼠3d可从回肠组织检测到目的基因的转录,以0.5×109、1×109和2×109 CFU口服对小鼠均具有安全性,重组菌在接种小鼠的肝、脾于4周左右逐渐被机体清除。结果表明成功构建TGEVS/N双基因疫苗SL7207(pVAX-S/N),该疫苗具有良好的稳定性与安全性等特点,为开展TGEV口服免疫研究奠定了基础。

猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆与表达及间接ELISA方法的建立

针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因B、C抗原位点编码基因片段(SBC,下同)设计合成1对引物,用PCR方法扩增SBC基因,将该基因片段定向插入到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-32a-SBC。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达大小约38 k D的蛋白,重组蛋白以包涵体的形式存在。Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测TGEV抗体的间接ELISA(TGEV SBC-ELISA)方法。表明建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比血清中和试验高,可用于TGEV的检疫和流行病学调查。

减毒沙门氏菌递呈的TGEVS／N融合基因疫苗的口服免疫原性

目的研究携带猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S/N融合基因的重组减毒沙门氏菌的口服免疫原性。方法将真核质粒pVAX-S/N电转化鼠伤寒减毒沙门氏菌SL7207,筛选获得疫苗菌株SL7207(pVAX-S/N)。将菌株SL7207(pVAX-S/N)及对照组SL7207(pVAX-S)以1×109 CFU/只灌胃免疫小鼠,测定免疫小鼠诱导的抗TGEV(和抗沙门氏菌均SL7207)的血清IgG及肠道粘膜IgA抗体动态水平,同时测定42d免疫小鼠的干扰素水平。结果菌株SL7207(pVAX-S/N)构建成功,首免后2～6周可诱导产生抗TGEV(和抗沙门氏菌SL7207)的血清IgG,第4～6周可诱导产生抗TGEV(和抗沙门氏菌均SL7207)的肠道粘膜IgA,SL7207(pVAX-S/N)诱导的IgG和IgA抗体最高滴度均略高于SL7207(pVAX-S),但差异不明显(P>0.05)。SL7207(pVAX-S/N)免疫42d小鼠诱导的干扰素浓度为659.45pg/mL,低于SL7207(pVAXD-S)组。结论 S/N融合基因疫苗SL7207(pVAX-S/N)具有良好的口服免疫原性,但与SL7207(pVAX-S)无明显差异。