动物细小病毒新型疫苗研究进展

细小病毒是动物病毒中最小最简单的一类单链线状DNA病毒,其在自然界的宿主范围广,感染后呈长期隐性感染,对畜牧养殖业有重要影响。目前,对细小病毒的防治仍以接种减毒疫苗和灭活疫苗为主,但它们仍存在一些不足,如:灭活疫苗成本高;减毒疫苗存在返强的可能性。因此,研制更安全、高效、制备方便的新型疫苗是未来研究的趋势。本文介绍了新型疫苗的发展概况以及近年来细小病毒新型疫苗的研究进展,以期为细小病毒新型疫苗的研究及应用提供参考。

OAS蛋白结构与抗病毒机制关系的研究进展

2＇-5＇寡聚腺苷酸合成酶（2＇-5＇oligoadenylate synthetase,OAS）是由Ian Kerr等最先在人体细胞中发现的,之后在小鼠、猪、牛、犬和低等生物如海绵动物体内也陆续发现了OAS[1-2]。

禽类干扰素受体介导的抗病毒免疫机制研究进展

干扰素受体作为一种"分子开关",参与调控宿主抗病毒免疫状态和细胞免疫因子的表达水平。作为抗病毒信号传导中的重要枢纽,干扰素受体表达水平的高低直接影响着机体抗病毒免疫反应状态。干扰素受体通过介导宿主抵抗外来病原体的信号级联放大效应来增强机体的抗病毒免疫状态。该正反馈调控机制是抗病毒感染中最重要的免疫扩大反应,也是宿主抵御病毒入侵和增殖的核心反应。禽类干扰素受体研究尚处于起步阶段,本文就干扰素受体的结构和分类,抗病毒效应蛋白质,以及禽类干扰素受体介导的抗病毒免疫机制的最新研究进展作一综述。

新型鹅细小病毒四川株的全基因组扩增及遗传进化分析

【目的】了解四川地区新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的分子生物学特征及遗传变异情况。【方法】根据Gen Bank中发表的新型鹅细小病毒的全基因组序列,设计5对兼并引物采用PCR方法分段扩增新型鹅细小病毒四川株的全基因组序列,并利用DNAstar等生物信息分析软件对获得的基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。【结果】获得的新型鹅细小病毒四川株(命名为SC16)全长5 109 nt,5′端ITR长408 nt,3′端ITR长407 nt,NS基因长1 884 nt,VP基因长2 199 nt。序列比对和遗传进化分析显示,SC16株与山东分离株SDLC01(KT343253.1)及QH15(KT751090.1)的基因组核苷酸同源性高达99%,与两者的亲缘关系最近,基于NS及VP蛋白的氨基酸序列系统进化树分析结果与此一致。但SC16株的5′端ITR还是发生了一定的变异:与SDLC01及QH15相比,多了几个14 nt的插入片段。【结论】研究结果丰富了NGPV的分子生物学资料。

多杀性巴氏杆菌脂多糖的结构与功能研究进展

多杀性巴氏杆菌是一种兼性厌氧的革兰阴性菌,能够造成多种动物的巴氏杆菌病。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)既是细菌重要的毒力因子,又是主要的保护性抗原。依据LPS血清学反应,多杀性巴氏杆菌可分为16个血清型。与大多数革兰阴性菌不同,多杀性巴氏杆菌的脂多糖不含O-抗原,仅由类脂A和核心寡糖两部分组成。近年来人们通过质谱检测和基因测序陆续揭示了这16个血清型核心寡糖的化学结构和合成基因。研究表明,各血清型内核心寡糖结构十分保守,合成基因分散存在于基因组;外核心寡糖的化学组成具有多样性,其合成基因成簇存在,形成外核心寡糖基因簇。虽然有些血清型共享同样的外核心寡糖基因簇,但由于基因突变造成它们外核心寡糖结构的异质性。研究还发现核心寡糖的结构与多杀性巴氏杆菌的毒力有关。作者在本文中综述了多杀性巴氏杆菌16个血清型的核心寡糖的化学结构、基因组成及其结构与毒力的关系,为多杀性巴氏杆菌病的防治提供借鉴。

鸭瘟病毒致病性研究进展

鸭瘟病毒(DPV)是一种主要感染鸭、鹅等雁形目禽类的一种泛嗜性病毒,感染机体后可在全身各组织器官中广泛分布并导致病理变化,主要侵嗜机体的免疫器官、神经组织以及消化器官等。DPV可诱导机体细胞凋亡,使机体的免疫器官受到损伤导致机体免疫力下降,进而有利于病毒在机体各组织器官的扩散;DPV可潜伏感染,并与细胞凋亡之间存在一定的关联。近年来,有关DPV的毒力基因等分子致病机制研究也取得一定进展。本文就DPV致病机理的研究进行总结,以期为鸭瘟的防控及以DPV为载体的禽类活载体疫苗的研究提供理论依据和参考。

鸭疫里默氏杆菌TbdR1表位抗原免疫原性研究

TbdR1(Ton B-dependent receptor 1)是鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)血清1、2和10型中的一个很好的交叉免疫原性抗原。通过生物信息学分析,分段表达TbdR1的表位抗原,并对其免疫原性进行初步探究。结果表明,分段后的表位抗原对雏鸭均具有一定的保护力,这为深入研究鸭疫里默氏杆菌亚单位疫苗奠定了基础。

四川白鹅CD4基因胞外去信号肽区的可溶性表达及纯化

根据Gen Bank公布的四川白鹅T细胞表面分子CD4基因序列设计特异性引物,扩增其胞外去信号肽区基因,将其构建成原核重组表达质粒go CD4-p ET-32a(+),并在大肠杆菌原核表达系统中进行可溶性表达并纯化,为进一步应用与研究提供基础。通过从成年四川白鹅胸腺组织中提取RNA,经反转录合成c DNA为模板扩增CD4基因胞外去信号肽区,并构建原核表达载体go CD4-p ET-32a(+)。在大肠杆菌Rosetta(DE3)p Lys S系统中进行原核表达,通过改变表达温度、培养基、诱导剂IPTG浓度、诱导时间以及抗性浓度等条件,最终获得可溶性表达并经NINTA亲和层析获得纯化蛋白。结果显示,鹅CD4胞外区蛋白只有在16℃的TB培养基中目的蛋白his-go CD4可表达,鉴定结果与预期相符,诱导表达成功且多以不可溶的包涵体形式存在。研究发现改变IPTG浓度对表达产物存在形式影响较大,最终筛选出以0.4 m M的IPTG条件作为可溶性表达的最佳诱导浓度。NI-NTA亲和层析获得纯化蛋白并经Western-blot验证。

干扰素刺激基因viperin所编码蛋白的结构与抗病毒功能的研究进展

Viperin（Virus inhibitory protein，endoplasmic reticulum—associated，interferon—inducible）是近年来新鉴定的定位于内质网膜上的抗病毒蛋白，主要通过干扰素依赖或非依赖途径被多种病毒等诱导表达而参与宿主抗病毒免疫反应。固有免疫是机体抵御外源病原体的第一道防线。病原以相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattems，PAMPs）进入宿主体，随即被其相应特异性模式识别受体（Patternrecognition receptors，PRRs）识别并结合，激活信号通路，诱导产生包括趋化因子及干扰素（Interferon，IFN）在内的细胞因子等广谱抗病原效应物质。

禽霍乱新型疫苗的研究进展

禽霍乱是一种禽类的接触性、系统性传染病,发病率和致死率高,给养禽业发展造成巨大的经济损失。随着病原菌抗生素耐药问题的日益严重,疫苗应成为防控该病的主要手段。目前应用于我国家禽产业的疫苗包括传统的灭活苗和弱毒苗,但它们具有一定缺陷,如油乳灭活苗交叉保护差;自然弱毒株遗传背景不明,毒力时而返强等。因此,研制安全、高效、制备方便的新型疫苗是迫切需求,也是未来研究的趋势。本文针对近年来开发的减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等多种禽霍乱新型疫苗进行综述,为研制更安全有效的疫苗提供一定的参考。

疱疹病毒UL11基因及其编码蛋白的研究进展

疱疹病毒在自然界分布广泛,可以感染两栖类、禽类、哺乳类,也能感染灵长类和人类。多数疱疹病毒感染后可以引起机体不同程度的临床症状和病理变化,如血管损伤、组织出血、消化道黏膜丘疹样病变、淋巴器官和实质器官的变性[1-2];但也有感染后无临床症状和病理变化的,如成年猪感染伪狂犬病毒为隐性感染[3]。疱疹病毒感染典型的流行病学特征是能够建立潜伏感染,感染或康复者长期携带病毒。因感染的人或动物会成为无症状的携带者,其仅在子代病毒间歇性地通过出芽、胞吐或诱导细胞凋亡而离开宿主细胞被释放时才能检测到,这使得疱疹病毒难以监测和控制[4]。

YFV17D非感染性报告复制子及假病毒包装系统的建立

构建YFV17D非感染性复制子及假病毒包装系统,旨在进一步解析黄热病毒的复制、组装分子机制。该研究利用反向遗传学技术,将基于SP6启动子的单拷贝YFV17D报告复制子改造成由CMV启动子驱动的低拷贝YFV17D报告复制子,同时将表达YFV17D结构蛋白的包装质粒与复制子质粒共同转染BHK-21细胞而建立YFV17D的反式假病毒包装系统。通过检测NanoLuc萤光素酶活性(Nluc)、oxGFP和mCherry荧光蛋白表达、间接免疫荧光实验监测病毒双链RNA来确定复制子在BHK-21细胞中复制情况和包装效果。结果表明,与复制缺陷型复制子相比,野生型复制子转染至BHK-21细胞中,随着转染时间的增加,Nluc活性、oxGFP和mCherry荧光蛋白表达也随之增加,同时dsRNA也随时间延长而增多。将复制子质粒和包装质粒共同转染至BHK-21细胞后,收集上清再次感染BHK-21细胞,随后通过检测Nluc活性和oxGFP与mCherry蛋白的表达而确定假病毒包装成功。综上,成功构建了携带不同报告基因的YFV17D复制子,用于监控病毒基因组RNA的复制;成功搭建由包装质粒提供的结构蛋白,将不具备感染性的YFV17D亚基因复制子打包成具有单轮感染能力的YFV17D假病毒系统。

基于鹅T细胞表面CD4分子胞外区的双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立鹅CD4分子(goCD4)双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以鼠抗goCD4-exc多克隆抗体为包被抗体,兔抗goCD4-exc多克隆抗体为检测抗体,确立判定标准,优化反应条件,建立了goCD4DAS-ELISA的检测方法。试验结果显示该方法最低检出量达5 pg/mL,具有较好的灵敏度。批内批间变异系数均低于2%,具有较好的重复性。将建立的双抗体ELISA方法初步应用于检测小鹅瘟病毒(GPV)感染的鹅脾单核细胞中CD4分子表达水平变化情况,结果显示GPV感染鹅脾单核细胞中goCD4分子表达水平极其显著高于未感染组。本研究建立的检测goCD4的DAS-ELISA方法有利于进一步研究禽类细胞免疫水平变化,并对实际生产中禽病检测及防控提供技术参考。

鼠伤寒沙门菌rmlD缺失株的构建及生物学特性分析

为了研究rml D缺失对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)生物学特性及毒力的影响,利用自杀质粒介导的同源重组技术,构建了rml D缺失株S100Δrml D,并对其生物特性进行了鉴定。结果显示,rml D的缺失不影响鼠伤寒沙门氏菌的生长特性及对多黏菌素B、胆酸盐的敏感性,但黏附和入侵人肠黏膜细胞INT407能力显著增加。同时,rml D缺失株毒力比野生株降低了约2000倍。以上结果表明,rml D的缺失不影响鼠伤寒沙门氏菌的体外生长及对宿主抗菌活性物质的敏感性,但能显著降低菌株毒力。因此,rml D的缺失可以作为一条有效的减毒途径。

革兰氏阴性菌血红素转运系统结构及功能特点

铁是大多数生物包括细菌生存的必需营养元素.对于感染宿主的致病细菌,血红素(heme/haem)可作为一种主要的铁来源.血红素转运系统在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中均有发现和鉴定,其转运机制在革兰氏阴性菌中有较为深入研究.革兰氏阴性菌血红素转运系统主要由分泌于细胞外的血红素载体(hemophore)、血红素受体、TonB-ExbB-ExbD复合物、ABC转运体、血红素降解蛋白和调控蛋白等结构单元组成.对参与该系统的各个蛋白结构特点以及它们之间的相互作用机制的讨论,有助于对病原菌致病机制的深入研究和抗菌新药的研发.

细菌铁离子利用系统与宿主抗感染免疫

铁离子对于绝大多数微生物及其宿主都是必需的营养物质,它是许多蛋白和酶的重要辅助因子。致病菌为了成功致病,进化出了多种机制来摄取宿主体内的铁离子,其中主要包括三价铁离子转运系统和亚铁血红素转运系统。而对于宿主而言,铁离子虽然在细胞呼吸和DNA复制等过程中扮演着重要的角色,但过多的铁离子也会产生细胞毒性。因此,宿主体内的铁离子浓度必须受到严格的调控。为限制病原菌感染,宿主先天性免疫系统进化出一系列限制自身铁离子进入微生物的机制,这一过程被称为宿主的"营养免疫"。从病原菌和宿主两个方面详细讨论病原菌是如何从宿主获取铁离子以及宿主如何防止细菌获取铁离子的分子机制,能为更好地提高宿主免疫力来阻止细菌感染和开发有效的非抗生素类药物提供理论依据。

CD40/CD40L在抗病毒免疫应答过程中的作用

CD40与其配体(CD40L)介导的信号转导通路激活是机体产生特异性免疫应答的必要条件,CD40/CD40L结合后,通过募集肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)后激活各种蛋白激酶来启动下游信号级联反应,从而调节下游基因的转录,启动和调节宿主的抗病毒免疫应答、抑制病毒的增殖与再活化。CD40L具有潜在的免疫增强作用,近年来,作为新型免疫佐剂,被广泛应用于多种病毒的疫苗研制中。此外,CD40/CD40L还通过其他非特异性免疫途径,对丙型肝炎病毒(HCV)、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、小鼠γ疱疹病毒68(MHV-68)等病毒也有抗病毒作用。但是对于不同病毒,CD40/CD40L发挥抗病毒作用所依赖的通路不尽相同,要全面揭示CD40/CD40L的抗病毒机制还需要更多更深入的研究。

细菌插入序列中的转座酶和转座机制

插入序列(insertion sequence, IS)是细菌中最简单的移动遗传因子,由两端的反向重复序列(inverted repeats, IR)和中间的转座酶(transposase)编码序列组成。在细菌中,因为插入序列的转座酶催化活性中心氨基酸序列不同,所以将其转座酶分为DDE转座酶、DEDD转座酶、HUH转座酶和丝氨酸转座酶。在转座过程中,根据插入序列是否有复制,将插入序列的转座分为复制型转座(replicative transposition)和非复制型转座(non-replicative transposition),而将形成夏皮罗中间体(Shapiro intermediate)的非复制型转座称为保守型转座(conservative transposition)。此外,插入序列通过不同的转座机制插入到基因编码区导致基因突变、缺失和倒置;或者插入到基因上游,通过自身启动子或与基因形成杂交启动子来影响插入序列下游基因的表达,从而帮助细菌抵抗复杂的环境变化。本文主要围绕细菌插入序列的特征、转座酶、转座机制和转座影响展开综述,以期为进一步研究插入序列的机制和插入序列在细菌中所起的作用提供参考。

鸭坦布苏病毒NS3蛋白的原核表达及其多克隆抗血清的制备

【目的】利用原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的NS3蛋白,并以此制备鼠抗NS3蛋白的多克隆抗血清。【方法】利用PCR扩增鸭坦布苏病毒CQW1株NS3基因片段,然后将其克隆到pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a(+)-NS3。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,筛选获得阳性重组菌,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot试验表明重组NS3蛋白在BL21细胞中成功表达,将重组NS3蛋白切胶纯化后免疫小鼠后收获抗血清。【结果】经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,多克隆抗血清可识别病毒感染细胞过程产生的NS3蛋白和真核表达的NS3蛋白,具有良好的反应性和特异性。【结论】成功制备的DTMUV NS3蛋白的鼠源多克隆血清,将为鸭坦布苏病毒的临床检测和NS3蛋白功能性研究奠定基础。

革兰氏阴性菌TonB-ExbB-ExbD复合物的功能、作用机制、分布及进化

革兰氏阴性菌在生长繁殖过程中需要从外界摄取营养物质。一些小分子营养物质可以自由地通过革兰氏阴性菌的细胞膜,而一些大分子营养物质的转运需要特异性的TonB复合物依赖性的外膜受体进行转运。TonB复合物由TonB、ExbB、ExbD构成,是革兰氏阴性菌对外界营养物质主动转运过程的能量提供单位,在革兰氏阴性菌分布广泛。近年来,对TonB-ExbB-ExbD复合物的功能、结构及作用机制取得了重大研究进展,然而此复合物在不同的细菌也存在功能及作用机制上的差异。基于此背景,本文综述了TonB复合物的功能和结构研究进展,并分析了TonB复合物在革兰氏阴性菌中的分布、进化,比较了不同革兰氏阴性菌此复合物的差异,有助于进一步发现和揭示TonB复合物的新功能与作用机制。