猪伪狂犬病、猪细小病毒病和猪流行性乙型脑炎检测基因芯片的制备及检测方法研究

对猪伪狂犬病(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒病(Porcine parvovirus,PPV)和猪流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)检测基因芯片的制备及该芯片的检测方法进行了研究。试验克隆和鉴定了16个芯片靶基因,经筛选,取其中13个靶基因PRV gB、gG、TK和gE;PPV NS2、NS3、VP1和VP2以及JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5制备PRV、PPV和JEV检测基因芯片,基因芯片点样系统SpotArrayTM 24将靶基因点样于氨基化玻片表面,靶基因最佳点样浓度为200 ng/μL,探针扩增标记反应体系中,Cy3-dCTP使用终浓度为2.5μmol/L,芯片杂交温度可在44℃～60℃之间任意选择。以PRRSV、CSFV、PCV1、PCV2、TGEV、HPS、PAP、E.coli和S.pp菌毒株DNA或CDNA为模板标记制备的探针均不与PRV、PPV、和JEV检测基因芯片杂交,芯片检测的灵敏度为3 pg/μL,芯片批间重复性好,同一张芯片可进行至少10次的重复杂交。该方法对8株PRV、5株PPV和JEV SA14-14-2单独或混合样品检测均为阳性,可区分伪狂犬病病毒野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品单独或混合感染的检出率分别为:单独感染PRV检出率15%(3/20),PPV 5%(1/20),JEV 0%(0/20);PRV和PPV混合感染检出率15%(3/20),PRV和JEV混合感染检出率5%(1/20),JEV和PPV混合感染检出率5%(1/20),三者混合感染的检出率5%(1/20)。与PRV、PPV和JEV多重PCR检测方法比较,芯片检测的灵敏度大大提高,同时可区分PRV野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品的检出率一致。

应用基因芯片技术检测禽重要疫病的研究——Ⅰ.4种禽病检测基因芯片靶基因的克隆及鉴定

对NDV、IBV、AIV和IBDV等病原进行了分子生物学特征分析,以RT-PCR分别扩增制备NDV、IBV、IBDV和AIV的靶基因,分别命名为ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、IB1、IB2、IB3、IB4、AI1、AI2和IBD1。并分别对制备的靶基因进行了克隆和鉴定分析,经BamHⅠ酶切、PCR和核酸序列测定鉴定分析表明,除T/WZ重组质粒外,T/ND1(F48E9),T/ND2(LaSota),T/ND3(LaSota),T/ND4(F48E9),T/ND5(LaSota),T/ND5(F48E9),T/IB1(SM),T/IB1(M41),T/IB2(SM),T/IB3(M41),T/WZ,T/AI1,T/AI2,T/IBD1等14个重组质粒,均是其病原的特异性基因。该批靶基因的成功克隆和鉴定为禽疫病检测基因芯片的构建和制备提供了确实可靠的靶基因材料,是禽类疫病基因检测芯片构建和制备的关键技术之一。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)诊断DNA微阵列的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）诊断DNA微阵列，应用RT—PCR从猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）C14—2分离株和欧洲型弱毒疫苗株VP046扩增并克隆获得戋洲型重组质粒C14P9（基因号：AY775132）、PRRS—PS9（基因号：AY775134）、Ulb（基因号：AY775135）、Y11（基因号：AY775133）、Y12（基因号：AY775136）和欧洲型基因重组质粒E6和E8。PCR法制备的靶基因和探针纯化后，质量浓度分别为300～600mg／L和200-400mg／L。芯片杂交动力学研究表明，杂堑信号强度随靶基因和探针浓度的增加而增强，最佳靶基因质量浓度为200mg／L，探针适宜范围为3～3000μg／L，系统灵敏性为3μg／L。靶基因杂交特异性研究表明，除个别靶基因在某一温度下存在交叉反应和杂交信号弱外，大多数靶基因在40～56℃下杂交信号强。采用AY775133、AY775134、E6和E8靶基因构建PRRS诊断DNA微阵列在40℃下预杂交1h、48℃湿盒避光杂交6h后经洗涤和扫读分析，杂交信号强、斑点明显、特异性高，按SNR≥1．5为标准能够区分PRRSV蔓洲型和欧洲型。应用PRRS诊断DNA微阵列检测了AMERVAC-PRRS、PRRSV弱毒疫苗、C14—2株、SCU株和临床样本，能正确区分PRRSV基因型。研究结果表明构建的PRRS诊断DNA微阵列可用于PRRS临床诊断和基因分型。

鹅副黏病毒和鹅细小病毒复合PCR检测方法的建立

鹅副黏病毒病（goose paramyxovirosis,GPMVS）和小鹅瘟（或称鹅细小病毒感染,goose parvovirus infection,GP）分别是由禽副黏病毒Ⅰ型病毒（Avian paramyxovirus-1,APM-1）和鹅细小病毒（Goose parvo-virus,GPV）引起的鹅的两大烈性传染病,是现代集约化养鹅业的主要疫病。GPMVS和GP的流行病学、临床症状和病理变化比较相似,在临床病例上,既有单一的GPMV或GPV感染,也有GPMV与GPV二重感染。