层次化教学在“微生物学”课程中的应用

"微生物学"是高等农业院校的专业基础课。当前,农业院校专业类群复杂,学生个体差异很大,社会竞争力较弱。针对上述问题,基于专业特色和培养目标的差异,在教学大纲、教学内容、教学目标和考核方式等方面采取层次化设计,因材施教,充分发挥学生的能动性,提升教学效果,提高人才培养质量。

不同施肥制度对石灰性紫色水稻土中氨氧化古菌群落结构的影响

研究不同施肥制度对水稻土氨氧化古菌(AOA)群落结构和垂直分布特征的影响,可以深入认识不同施肥制度下的石灰性紫色水稻土氮素循环特征及微生物驱动机制,为该地区科学施肥、培肥地力提供理论依据。利用化学分析和变性梯度凝胶电泳(DGGE)对不同施肥制度下石灰性紫色水稻土理化性质和AOA群落结构进行了分析。结果显示:相对于无肥处理,施肥会降低石灰性紫色水稻土pH和硝氮含量,而增加土壤有机质、全氮和氨氮含量。伴随土壤深度增加,土壤pH增加,全氮和硝氮含量降低,氨氮含量变化趋势不明显。不同施肥制度在不同土壤深度对石灰性紫色水稻土AOA群落结构产生不同的胁迫效应,不同施肥制度下的AOA群落结构在0—20 cm处差异不明显;土壤深度增加,不同施肥制度下的AOA群落结构表现出明显差异,CK和N肥处理下的AOA群落结构较简单。AOA群落结构多样性指数和丰富度随土壤深度增加而减小。石灰性紫色水稻土AOA与来自不同土壤和水体环境的AOA具有明显相似性。冗余梯度分析(RDA)显示pH(P=0.012)是造成石灰性紫色水稻土AOA群落结构差异的主要原因。研究揭示石灰性紫色水稻土中的AOA群落结构受施肥制度明显影响并表现出明显的垂直分布特征。

pH对香菇多糖含量及合成关键酶基因转录水平的影响

香菇是一种药食两用真菌,其主要代谢产物香菇多糖具有较高药用价值,研究香菇多糖代谢途径对提高香菇多糖含量具有较大参考价值。以香菇新808为材料,苯酚-硫酸法测定不同pH发酵条件下香菇多糖的含量,通过荧光定量PCR及3个软件(GeNorm、NormFinder和BestKeeper)筛选出了不同pH条件香菇稳定表达的内参基因,并以此为基础分析多糖代谢途径中3个关键酶基因的转录表达水平。结果表明,在实验用pH值范围内(5.0-7.0),香菇菌丝体生物量和胞内多糖含量随着pH值的升高而增加,而胞外多糖含量则呈下降趋势;18S和rpl4分别被鉴定为不同pH发酵条件下最稳定和最不稳定表达的内参基因。不同pH发酵条件UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)的相对表达量明显高于葡萄糖磷酸变位酶基因(PGM)与葡萄糖磷酸异构酶基因(PGI);PGM相对表达量小且稳定,PGI相对表达量较小,但随pH值的变化波动较大。不同pH对香菇生物量及多糖含量的影响存在差异,3个关键酶基因的转录表达水平与多糖含量之间无明显相关性。

石灰性紫色水稻土不同土壤深度中厌氧氨氧化细菌对施肥的响应

【目的】研究长期不同施肥处理对水稻土厌氧氨氧化细菌(anaerobic ammonium oxidation bacteria,AAOB)群落结构和垂直分布特征的影响,深入认识不同施肥处理下石灰性紫色水稻土厌氧氨氧化作用的微生物调控机制,为该地区科学施肥、培肥地力提供理论依据。【方法】利用化学分析、末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)和荧光定量PCR技术分别对不同施肥处理下石灰性紫色水稻土理化性质、厌氧氨氧化细菌丰度及群落结构进行分析。【结果】理化性质结果显示,相对于无肥处理(CK),氮(N)、氮磷钾肥(NPK)及氮磷钾配施农家肥(NPKM)均会降低土壤p H和硝态氮含量,而增加土壤有机质、全氮和铵态氮含量。随土壤深度增加,土壤p H增加,全氮和硝态氮含量降低,铵态氮含量变化趋势不明显。q PCR结果显示,就土壤层次而言,厌氧氨氧化细菌在0—20 cm层的丰度最高,20—40 cm层最低;就施肥处理而言,氮肥(N)对厌氧氨氧化细菌的丰度促进最为明显。T-RFLP结果表明,厌氧氨氧化细菌在0—20 cm土层群落组成最为丰富,Shannon-wiener多样性指数最高;寡氮肥下其群落组成最为简单,无肥处理下群落结构最为复杂。厌氧氨氧化细菌优势种群属于Candidatus Brocadia。冗余梯度分析(RDA)显示,p H影响是石灰性紫色水稻土厌氧氨氧化细菌群落结构差异的主要环境因子。【结论】本研究显示寡氮处理会降低石灰性紫色水稻土中厌氧氨氧化细菌的多样性但促进其丰度。表层土(0—20 cm)是厌氧氨氧化细菌分布的主要层次。

蒽对3株灵芝菌株漆酶活性及其转录表达水平的影响

探索多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)蒽对不同灵芝菌株漆酶活性及其转录表达的影响。以 3 株灵芝菌株(美芝、荣保 1 号和川芝)为实验材料,避光静置培养 5 d 后,加入终浓度为 1.0 mg/L 的蒽,避光处理 1 h、3 h、6 h、9 h 和 24 h,收集上清液测定漆酶活性,菌丝体样品提取 RNA,分析多环芳烃蒽对漆酶活性和转录表达水平的影响。结果显示,蒽对 3 株菌株的漆酶活性及转录表达水平的影响均存在差异。3 株灵芝菌株中,川芝的漆酶活性最高,美芝次之,荣保 1 号酶活最低。荣保 1 号漆酶活性随着处理时间的延长而上升,培养前期活性被为抑制,后期则被促进;美芝漆酶活性变化趋势类似于荣保 1 号,变化幅度较小;川芝漆酶活性受到强烈抑制,且随着时间的变化差异不明显。蒽处理下,美芝漆酶基因转录表达水平差异较小,大部分基因在处理 9 h 后出现转录表达水平峰值;荣保 1 号漆酶基因的表达水平类似于美芝;川芝漆酶在短期处理下,转录表达水平大幅上调,随着处理时间的延长,转录表达水平下调。3 株灵芝菌株漆酶活性和漆酶基因转录表达水平对蒽的响应各不相同,其中川芝较敏感,荣保 1 号次之,美芝变化幅度最小,耐受力最强。

不同浓度Fe2+和Cu2+胁迫对灵芝寡肽转运蛋白基因家族的转录表达水平的影响

前期研究发现在Fe2+和Cu2+胁迫下,OPT基因转录表达水平会有较大的变化。为进一步探究这两种金属对OPT基因的影响,分析了不同浓度Fe2+和Cu2+胁迫下灵芝寡肽转运蛋白基因家族的转录表达水平。以灵芝荣保1号为实验材料,设置不同浓度梯度(0、50、100、200和400 mg/L)Fe2+和Cu2+进行液体静置培养,分别于15 d和30 d收集样品,测定生物量和多糖含量,利用实时荧光定量PCR技术分析OPT基因的转录表达水平。结果表明,Fe2+对灵芝的生长有一定的促进作用,Cu2+则对其有抑制作用。两种金属在实验用的浓度范围内对于灵芝多糖含量在培养前期表现出抑制作用,后期则有一定的促进作用。除未检测到转录本的3个OPT基因(OPT7、OPT8和OPT9),其余OPT基因的转录表达均有差异性。培养前期(15 d),Cu2+胁迫下OPTs基因表达水平较低且差异不明显,Fe2+胁迫下OPTs基因表达水平差异较大;培养后期(30 d),Cu2+胁迫下OPTs基因表达水平较15 d的样品明显增加,且存在差异,Fe2+胁迫下绝大多数OPTs基因均在浓度为200 mg/L下转录表达水平最高。实验证明,不同浓度Fe2+和Cu2+对灵芝的生物量与多糖含量存在不同程度的影响,同时OPT基因在转录水平上也做出了不同的响应,表明其在灵芝适应与吸附外界金属离子的过程起到了重要的作用。

镍胁迫下产铁载体细菌对花生的促生性

【目的】挖掘镍耐受性强、产铁载体活性高的植物根际促生细菌,研究镍胁迫下产铁载体细菌对花生的促生作用及其对花生吸收镍的影响。【方法】利用CAS(Chrome azurol S)培养基对花生根际产铁载体细菌定性筛选及定量测试获得产铁载体能力强的菌株,16S r RNA基因相似性及系统进化分析鉴定产铁载体细菌,并用含Ni^(2+)牛肉膏蛋白胨培养基测试细菌对Ni的耐受性;通过花生盆栽实验,测试花生的株高、根长、生物量、氮磷钾含量及镍含量来分析镍胁迫下产铁载体细菌对花生的影响。【结果】从花生根际分离筛选产铁载体芽孢杆菌5株,其中HSGJ1产铁载体能力最强,培养2 d后产156.56 mg/L的铁载体。HSGJ1对Ni^(2+)具有较强的耐受性,最小致死浓度为150 mg/L。在50、100 mg/kg的Ni^(2+)盆栽基质中,HSGJ1能够有效地促进花生的生长、增加花生的生物量及氮磷钾含量,并使花生根部和地上部分的镍含量降低。【结论】产铁载体芽孢杆菌HSGJ1是一株优良的植物根际促生细菌,可应用于镍污染农耕土壤的作物种植中,以提高作物在镍胁迫下的抗逆性,降低作物对镍的富集量,具有较好的应用价值。

铬污染区糙野青茅内生耐铬细菌筛选及其促生能力

以铬污染区糙野青茅[Deyeuxia scabrescens(Griseb.)]为研究对象,从中分离耐重金属铬的内生菌,获得对重金属铬有强耐受性和具有促生功能的细菌,为微生物与植物联合修复重金属污染提供菌种资源.采用LB培养基,以涂布和撒接两种分离方法获得内生细菌,通过内生细菌在不同铬浓度培养基的生长状况来判断其对于重金属铬的耐受性,初筛耐受性强的菌株培养于含铬LB液体培养基培养后测定其OD值,以验证其对铬的耐受性.将耐铬能力突出的菌株接种于含铬LB液体培养基培养后测定培养基中的残留铬含量,初探其去铬能力,并分析耐铬菌株多样性和产吲哚乙酸IAA、产铁载体、溶磷、降解纤维素等促生能力.结果显示:从糙野青茅中共分离得到33株内生细菌,其中27株表现出较强的铬耐受性,5株细菌的铬耐受浓度高达1 000μg/m L.2株菌在铬浓度为300μg/m L的处理下培养48 h后去铬率分别为79.55%和75.27%.经16S rDNA序列测定,内生细菌属于Bacillus、Staphylococcus、Terribacillus、Ochrobacterium、Ignatzschineria、Alcaligenes 6个属.24株菌(88.89%)具有产IAA能力,18株菌(66.67%)具有产铁载体能力,10株菌(37.04%)具有溶磷能力,13株菌(48.15%)具有降解纤维素能力.本研究表明,铬污染区植物内生细菌在铬污染土壤的生物修复中具有很大潜力.

4种重金属对灵芝漆酶活性及转录表达的影响

漆酶是一种分布广泛的多酚氧化酶,在食品、能源和环保等领域具有重要的应用价值.灵芝作为重要的白腐真菌,可以合成分泌包括漆酶在内的多种木质纤维素降解酶,这些酶的活性会随着菌株、发酵条件等不同而不同.以灵芝荣保1号为材料,利用平板实验分析4种重金属(Pb^(2+)、Cd^(2+)、Cu^(2+)和Fe^(2+))在不同浓度下对灵芝菌丝体生长及氧化带形成的影响,用分光光度法测定重金属发酵液中漆酶的活性,并通过实时定量PCR检测重金属离子胁迫下灵芝漆酶同工酶表达的差异性和特异性.结果表明:低浓度Pb^(2+)和Cu^(2+)促进菌丝体生长和氧化带形成,而Cd^(2+)和Fe^(2+)抑制菌丝生长及氧化带形成;Pb^(2+)、Cd^(2+)、Cu^(2+)和Fe^(2+)分别以终浓度为100、20、100、100 mg/kg时对菌丝生长及氧化带的增强作用较大,培养至第11天、第9天、第7天、第7天时,漆酶活性达到最大值,分别为20.83±0.32、15.89±0.21、30.56±0.42、9.44±0.25 U/L,Cu^(2+)促进了发酵液中漆酶酶活,而Pb^(2+)、Cd^(2+)和Fe^(2+)则抑制漆酶酶活.荧光定量PCR结果显示,4种重金属离子在液体培养条件下对15个灵芝漆酶同工酶的转录表达影响存在差异性,其中5个漆酶基因(Glac4、Glac6、Glac10、Glac11和Glac12)转录表达发生上调.综上,灵芝漆酶对重金属离子作用的不同响应表明其具有较复杂的生理功能及调控机制,结果可为进一步阐明漆酶作用机制提供基础.

九香虫(椿象)体内可培养细菌的多样性分析

【目的】认识药用昆虫九香虫(Aspongopus chinesis Dallas)成虫体内可培养细菌资源多样性。【方法】运用纯培养法、反转录重复因子扩增(BOXA1R-PCR)分析技术、16S r RNA基因测序和系统发育分析对样品中可培养细菌进行多样性研究,测定了分离菌株的抗菌特性、吲哚乙酸(IAA)含量和产淀粉酶活性等指标。【结果】通过6种不同培养基共分离得到52株菌落特征不同的细菌菌株。基于菌落特征和BOXA1R-PCR图谱选取12株代表菌株用于16S r RNA基因序列测定。16S r RNA基因序列系统发育分析显示,52株菌株分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)4个属,其中芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。分离到的52株细菌有44株(占总分离菌株的84.6%)表现出对供试病原菌具有较好的抑制作用,高达94.2%的分离菌株能产IAA,有43株(占总分离菌株的82.7%)表现出淀粉酶活性。【结论】九香虫内细菌种群较为多样,具有潜在应用价值。

香菇漆酶高产菌株筛选及漆酶基因的表达研究

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,其作用底物范围广,在食品、能源和环保等领域具有重要的应用价值,因此筛选高产漆酶菌株对于其工业应用具有重要意义。本实验以78株香菇菌株为实验材料,利用愈创木酚平板法初筛,液体发酵复筛的方法筛选高产漆酶香菇菌株,并通过实时定量PCR分析香菇漆酶同工酶在不同菌株之间转录表达的差异性和特异性。结果表明,不同香菇菌株的生长速度、变色圈大小存在差异,以菌丝圈和变色圈大小及其比例为依据,从78株香菇菌株中筛选出19株潜在的漆酶高产菌株;液体发酵从这19株菌株中复筛出3株高产漆酶的菌株:香240、15和冕宁浅灰,其中香240在培养第3天酶活达到最高(3.583U/m L),香15和冕宁浅灰则在培养第7天酶活达到最高(分别为3.842U/m L和2.806U/m L);实时荧光定量PCR结果显示,10个漆酶同工酶基因在两株香菇菌株中的表达存在差异性和特异性,其中Lelac5和Lelac9只在菌株香240中检测到转录本;Lelac1–4在菌株15中表达量较高,而Lelac8、Lelac10和Lelac11在香240中的表达量较高。研究结果将为香菇漆酶的进一步研究提供基础。

香菇生长发育过程中漆酶基因家族的转录表达

香菇可分泌胞外漆酶降解木质素作为自身营养物质. 为探究不同漆酶基因在香菇生长发育过程中的不同作用，采用RT-qPCR方法分析10个漆酶基因在香菇4个不同发育阶段（菌丝体、原基、幼小子实体和成熟子实体）的转录表达情况. 结果显示，5个漆酶基因（Lelac1、Lelac3、Lelac5、Lelac8和Lelac9）的转录表达表现出差异性和发育阶段特异性，另外5个漆酶基因（Lelac2、Lelac4、Lelac7、Lelac10和Lelac11）只表现出差异性. Lelac2和Lelac3随着香菇的生长，其转录表达量持续上升，可能与成菇过程有关；Lelac1和Lelac7在菌丝体阶段大量表达，可能参与菌丝体的生长代谢；Lelac8在原基时期表达量显著高于其他时期，与原基分化有关. 本研究表明漆酶基因在香菇不同发育阶段的转录表达存在差异，结果可为进一步阐明漆酶在香菇生长发育阶段的作用奠定基础. （图3 表1 参19）

金属胁迫下灵芝寡肽转运蛋白基因家族的转录表达

【目的】寡肽转运蛋白(Oligopeptide transporters,OPTs)通过细胞质膜,将细胞外环境中的物质转入细胞内,从而参与各种生理活动。植物中OPTs蛋白参与金属运输和分配,从而促进植物对金属的利用和适应,但真菌中OPTs是否参与这一过程的相关报道较少。探究OPTs是否在灵芝对金属的适应过程中发挥作用。【方法】以灵芝荣保1号为材料,利用平板实验分析不同浓度的Cu2+、Fe2+和Se4+对菌丝体生长和生物量的影响,并采用实时荧光定量PCR分析不同金属离子胁迫下,两个培养阶段(15 d和30 d)灵芝寡肽转运蛋白基因(OPTs)的转录表达水平。【结果】Cu2+、Fe2+和Se4+三个金属离子在实验使用的浓度范围内抑制灵芝菌丝体的生长量和生物量,且在相同处理条件下的生长量与生物量的变化趋势相同。荧光定量PCR结果显示,除未检测到转录本的3个基因(OPT7、OPT8和OPT9),其余10个基因均表现出了差异性表达模式。在培养前期(15 d),有6个寡肽转运蛋白基因(OPT1、OPT3-6和OPT10)的相对表达量在Cu2+的胁迫下发生上调,而在Fe2+和Se4+的胁迫下,所有的OPTs基因的表达量均被下调。在培养后期(30 d),Se4+胁迫下的OPTs基因的表达量仍旧被下调,而Cu2+和Fe2+的胁迫下表达量均显著上调。【结论】金属能够在不同的程度上影响灵芝的生长量和生物量,同时寡肽转运蛋白基因对这些金属胁迫在转录水平上做出了响应,表明寡肽转运蛋白基因可能在灵芝对金属的适应过程中发挥作用。

万顺铅锌矿区蜈蚣草内生细菌砷氧化基因(aox B)的多样性分析

【背景】近年来,由于金属矿的开采和冶炼、砷产品的加工与使用、煤的燃烧等各种因素,导致土壤环境中的砷污染越来越严重,导致许多人暴露于极度危险的砷毒毒害之下。【目的】研究四川的万顺铅锌矿区蜈蚣草根组织内生细菌aoxB基因的多样性,为提高土壤重金属污染生态修复效率提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR,qPCR)和限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)技术,对四川省汉源县万顺铅锌矿区蜈蚣草根组织内生细菌aoxB基因表达量及多样性进行研究。【结果】qPCR结果表明,不同采样点间的蜈蚣草根组织内生细菌aoxB基因表达量存在明显差异,表现为选矿区>进山口>弃渣场>尾矿区>矿口。酶切图谱结果表明,不同采样点蜈蚣草根组织内生细菌aoxB基因多样性存在明显差异,多样性指数表现为尾矿>矿口>弃渣场>进山口>选矿区。Pearson相关分析显示,aoxB基因的表达量与重金属As之间呈显著负相关(P<0.05),多样性指数则与重金属Pb和As之间呈极显著正相关(P<0.01)。系统发育分析显示,aoxB基因的优势菌群为α-变形菌门(Alphaproteobacteria)。【结论】蜈蚣草根组织中存在丰富的含aoxB基因内生细菌种群,这些内生细菌表现出潜在的应用价值。