5-Aza联合低浓度HS分阶段诱导人和大鼠BMMSC向肌细胞分化的研究

【目的】评价5-Aza联合20mL/LHS方案诱导人和大鼠BMMSC向肌细胞分化的可行性,揭示BMMSC肌分化的机制,尝试建立一种简便、有效、稳定的诱导BMMSC肌分化方法。【方法】首先分离纯化SD大鼠BMMSC,显微镜下观察人和大鼠BMMSC生长和形态。接着,应用5-Aza联合20mL/LHS诱导BMMSC向肌细胞分化,通过免疫细胞化学和RT-PCR方法分别检测肌标志性分子基因表达情况。【结果】①5-Aza联合20mL/LHS诱导人和大鼠BMMSC向肌系分化效能截然不同:对hBMMSC,无论形态学还是免疫细胞化学及RT-PCR均无明显改变;对SD BMMSC,显示了促肌分化的作用(刺激后desmin,MyoD,myogenin mRMA表达水平上调,Pax7表达水平下调),但形态学无改变。②高代数的MSC不利诱导分化。③Pax3和MRF4分子在诱导前后均无表达。【结论】①5-Aza联合20mL/LHS诱导BMMSC向肌细胞分化结果因品系不同而异。②5-Aza作为MSCs肌分化诱导剂,有早期启蒙作用,但其作用和机制还需进一步明确。③一些肌相关分子的表达受细胞品系、细胞来源、细胞状态等因素影响。

C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验

【目的】观察低浓度马血清体外诱导成肌细胞C2C12向成熟肌细胞分化、形成肌管的作用,探索定向诱导肌分化的途径及其分子机制。【方法】将C2C12成肌细胞用含不同浓度马血清的高糖DMEM培养基培养,收集细胞,在相差显微镜下观察形态变化,并通过免疫细胞化学(Imminocytochemistry,ICC)及RT-PCR方法分别检测肌性相关基因表达的改变。【结果】①20mL/L和50mL/L的马血清均能促使C2C12细胞形成肌小管,20mL/L浓度马血清诱导效率最好(第7天时肌小管形成率分别为31.4%±2.1%和19.0%±1.6%,P<0.001)。②20mL/L马血清诱导3～4d开始有肌管形成,之后肌管越来越多,到8～9d达高峰(第9天40.2%±1.3%),往后细胞逐渐衰老死亡。③20mL/L马血清诱导C2C12细胞向成熟肌细胞分化过程中,肌相关蛋白分子表达发生变化:结蛋白(desmin)、成肌分化抗原(MyoD)、生肌素(myogenin)和肌球蛋白(myosin)等表达逐渐增强(未刺激时分别约为49.6%±1.1%、23.4%±1.1%、4.8%±1.6%和2.6%±1.5%;第6天时分别提高为80.4%±1.8%、85.4%±1.1%、22.2%±1.1%和26.0%±1.6%;P<0.001);desmin、MyoD和myogenin相应的mRNA分子也可以通过RT-PCR检测到。【结论】①低浓度的马血清能够有效刺激C2C12成肌细胞向成熟细胞分化,以20mL/L浓度效果最好;②C2C12细胞是研究肌细胞发育分化的理想模板;③肌分化发育过程比较复杂,许多因素都可能起影响,研究设计要尽量标准化。