重组酵母测评系统检测环境雌激素的影响因素探讨

目的 :探讨重组酵母测评系统中影响 β -半乳糖苷酶活性的因素。 方法 :以乙烯雌酚为受试物 ,研究在检测环境雌激素的重组酵母测评系统中 ,振荡和非振荡培养、酵母扩增时间、受试物作用时间和裂解方式等对酶活性的影响。结果 :在非振荡培养条件下 ,可检出乙烯雌酚的雌激素活性 ,且与振荡培养条件下的雌激素活性差异无统计学意义(P >0 0 5 )。非振荡培养时 ,在 18～ 30h内 ,随酵母扩增时间的延长 ,酶活性逐渐增加 ,30h后 ,酶活性则随扩增时间的延长而逐渐降低 ;各剂量组的乙烯雌酚作用时间以 30h时酶活性最高 ,若将作用时间延长至 4 8h ,酶活性则明显下降 (P<0 0 1) ;在不同裂解方式下 ,各剂量组乙烯雌酚的酶活性大小顺序为 :液氮裂解 >Y -PER裂解 >彗星实验裂解液裂解 >SDS +氯仿 (CHCl3 )裂解 >超声破碎。结论 :重组酵母测评系统检测环境雌激素的优化组合为 :恒温培养箱中酵母扩增 2 4～ 30h ,受试物作用 30h ,Y -PER或液氮裂解酵母细胞。

重组酵母测评系统对环境样品雌激素活性的检测

采用重组酵母测评系统对香烟烟雾溶液和汽车尾气提取物分别进行雌激素活性的测定.结果显示在受试浓度下,PBS烟雾溶液和DMSO烟雾溶液的β-半乳糖苷酶活性与溶剂对照相比均无显著性差异(P>0·05).汽油燃料车尾气在600mL·mL-1时,其酵母菌液OD600明显低于DMSO对照组(P<0·05);在150mL·mL-1剂量时,汽油燃料车尾气所检出的β-半乳糖苷酶活性为44·56,与DMSO对照组相比有显著性差异(P<0·05),当剂量增加至300mL·mL-1,酶活性升高为66·43,约为对照组的12倍,其它各剂量组酶活性与DMSO对照组相比无显著性差异(P>0·05);甲醇燃料车尾气的β-半乳糖苷酶活性与溶剂对照相比无显著性差异(P>0·05).提示汽油燃料车尾气具有弱雌激素活性,甲醇燃料车尾气和香烟烟雾溶液未检出雌激素活性.

甲状腺素干扰物对甲状腺滤泡细胞分泌甲状腺球蛋白功能的影响

目的了解几种典型甲状腺素干扰物对甲状腺滤泡(FRTL-5)细胞分泌甲状腺球蛋白功能的影响,探讨其干扰甲状腺素水平的细胞学机制及建立甲状腺素干扰物甄别方法的可行性。方法将大鼠FRTL-5细胞体外培养后接种于24孔培养板,每孔细胞数2×105个,待细胞贴壁后分别加入受试物丙硫氧嘧啶、叶枯宁[N,N-甲撑-双(2-氨基-5-巯基-1,3,4-噻二唑)]、磺胺二甲嘧啶和杀草强,各设1组溶剂对照,置CO2孵箱培养48h后,每孔取1ml培养液,用放射免疫法测定甲状腺球蛋白的浓度。结果4个实验组的甲状腺球蛋白浓度与对照组相比均降低,差异有显著性(P<0.05),且可能存在剂量-效应关系。结论降低甲状腺细胞合成或分泌甲状腺球蛋白可能是这4种甲状腺素干扰物的作用机制之一。FRTL-5细胞分泌甲状腺球蛋白的功能是一个相对灵敏的指标,与其他体内体外实验结合可用于甲状腺素干扰物的一阶段甄别(初筛)方法。

番茄汁对DNA损伤的保护作用研究

目的探讨番茄汁对人正常细胞和肿瘤细胞增殖的影响及DNA损伤的保护作用。方法采用MTT法检测不同剂量的番茄汁对细胞增殖的影响，彗星实验检测不同剂量番茄汁对细胞DNA的影响及对DNA损伤的保护作用。结果当番茄汁体积在培养液中所占比例低于15％时。对正常细胞和肿瘤细胞的增殖没有任何影响；当番茄汁在培养液中所占比例达到或超过20％时。此时的培养液不是细胞生长的最适条件，表现为细胞生长抑制。番茄汁在培养液中体积分数为50-500μL／mL时没有引起细胞DNA损伤，而低浓度（20～100μL／mL）番茄汁对重铬酸钾诱导的DNA损伤具有明显的保护作用，该作用随着番茄汁剂量的增加而增强。表现为拖尾细胞减少,尾长减短，番茄汁剂量与拖尾细胞尾长具有明显的剂量-反应关系。呈负相关（r=-0．917，P=0．00369）。肿瘤细胞和正常细胞实验结果一致。结论番茄汁不但不会引起细胞DNA损伤。而且对重铬酸钾诱导的DNA损伤具有明显的保护作用；此外，在研究番茄汁对细胞增殖影响时应该注意番茄汁在培养液中所占的体积，本实验显示番茄汁不能超过20％，否则会得到错误的结论。

甲醇和汽油汽车尾气对A549细胞株细胞毒性及增殖和凋亡功能的影响

目的:比较甲醇燃料汽车尾气和汽油燃料汽车尾气对A549细胞株的细胞毒性及增殖和凋亡功能的影响.方法:1)MTT比色法检测受试物细胞毒性.2)受试物体外培养实验:汽油组剂量分组为:0.125 L/ml,0.062 5 L/ml,0.03125L/ml,0.015 6 L/ml,0.007 8 L/ml和一个空白对照;甲醇组剂量分组与汽油相同.A.细胞培养介质乳酸脱氢酶活性的测定;B.细胞形态学观察;C.流式细胞术a.检测细胞周期并计算细胞增殖指数;b.观察细胞亚二倍体峰的变化,计算凋亡百分比;结果:1)MTT比色法汽油组在0.125 L/ml剂量组OD值与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);甲醇组在1.0L/ml剂量组OD值与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);2)受试物体外培养实验:A.细胞培养介质乳酸脱氢酶活性的测定:汽油组在0.0625～0.125 L/ml各剂量组LDH值与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05),同等剂量下甲醇组与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);B.细胞形态学观察:汽油组在0.125 L/ml,可见大量死亡细胞和凋亡细胞数增加,相同剂量甲醇组未见明显改变;C.流式细胞术:仅汽油组0.015 6,0.031 25L/ml、0.062 5 L/ml剂量组细胞增殖指数显著低于对照组(P＜0.05),汽油组和甲醇组在0.015 6～0.062 5 L/ml剂量组凋亡百分比均高于对照组,但后者作用更强.结论:在同等剂量下,汽油燃料尾气对A549细胞株的毒性及对细胞增殖的抑制明显高于甲醇,但甲醇诱导A549细胞凋亡的作用略强.

自然老龄小鼠与D-半乳糖衰老模型小鼠的比较

目的 :选择鉴定抗衰老作用的合适动物。方法 :选用自然老龄鼠和 D-半乳糖模型鼠 ,以红细胞 SOD(超氧化物歧化酶 )和肝匀浆 MDA (丙二醛 )含量为指标 ,分别与年轻对照鼠比较。结果 :D-半乳糖模型鼠与年轻对照鼠间仅 SOD活力单位有显著差异 ,自然老龄鼠的上述两项指标均与年轻对照鼠有显著差异。结论 :自然老龄鼠是鉴定抗衰老作用的首选动物。

香烟烟雾对人支气管上皮细胞的氧化损伤研究

目的探讨香烟烟雾对人支气管上皮细胞氧化损伤的影响,评价氧化损伤效应在香烟烟雾致肺癌中的作用。方法体外培养人支气管上皮细胞(HBE),以DMSO作为吸收液采集香烟主流烟雾,MTT比色法测量香烟烟雾对HBE细胞的毒性,彗星实验和微核实验分别检测细胞DNA链断裂和细胞染色体损伤,同时使用荧光探针测定细胞内活性氧(ROS)的含量。结果随着香烟烟雾浓度的增加,HBE细胞存活率逐渐下降;随着染毒时间的延长,香烟烟雾对HBE细胞的半数抑制浓度(IC50)逐渐降低,显示明显的剂量-效应和时间-效应关系。香烟烟雾可以诱导HBE细胞DNA链断裂,表现为细胞拖尾率增加,同时尾长、尾部DNA含量和Olive尾距均随香烟烟雾浓度增加而增大。香烟烟雾亦可诱导HBE细胞染色体损伤,当香烟烟雾浓度≥1支/L时,实验组微核率与对照组比差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,HBE细胞ROS生成量与香烟烟雾浓度呈剂量-效应关系。结论香烟烟雾可以直接诱导人支气管上皮细胞ROS增加,从而造成细胞毒性增加、染色体损伤和DNA链断裂,提示氧化损伤是香烟烟雾致肺癌的重要机制。

大豆异黄酮对^(60)Co γ射线所致氧化损伤的保护作用研究

目的:研究大豆异黄酮(SI)对60Coγ射线照射小鼠氧化损伤及组织细胞DNA损伤的保护作用。方法:将小鼠随机分为SI高、中、低剂量组(333、167、83mg/kgbw)、模型组和对照组。辐射前,各剂量组每日给予不同剂量SI;模型组和对照组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液。30d后,除对照组外,各组给予15Gy60Coγ射线全身一次性照射。照后D4处死动物,测定肝匀浆MDA含量,SOD和GSH-Px活性。同时各组分别取3只小鼠的肝、脾、肾、血进行彗星实验以观察细胞DNA损伤情况。结果:与对照组比,模型组MDA含量显著增高(P<0.01),SOD和GSH-Px活性显著降低(P<0.05);与模型组比,SI剂量组MDA含量显著降低(P<0.05)、SOD和GSH-Px活性显著增高(P<0.05)。模型组4种组织细胞之间DNA损伤程度不同,均显著高于各自的对照组(P<0.05),且SI剂量组的DNA损伤程度显著低于模型组(P<0.05),并随着SI剂量的增加,DNA损伤程度相应减轻。结论:SI对辐射所造成的氧化及DNA损伤具有保护作用。

职业砷接触工人某些遗传毒性指标的变化

目的探讨职业砷接触工人某些遗传毒性指标的变化。方法选择云南某砒霜厂40人为接触组,当地无明显毒物接触史28人为对照组,检测并评价外周血淋巴细胞微核细胞率、微核率、彗星试验拖尾率和尾长,以及尿中总砷、有机砷水平。结果接触组外周血淋巴细胞微核细胞率、微核率、彗星试验拖尾率、尾长均极显著高于对照组(P<0.01)。尿中总砷、有机砷浓度也高于对照组(均低于0.02mg/L)。微核细胞率和微核率随有机砷浓度、工龄乘积增加有升高趋势(rs=0.356,P=0.024;rs=0.347,P=0.028)。结论职业性砷暴露可导致外周血淋巴细胞染色体和DNA损伤。

^(60)Coγ射线对小鼠组织细胞氧化损伤的研究

目的:研究60Coγ射线对小鼠组织细胞DNA的氧化损伤及其对组织抗氧化系统的影响。方法:小鼠接受60Coγ射线全身一次性照射(吸收剂量分别为7Gy、10Gy、15Gy)后,用彗星试验对其肝、脾、肾及血液组织细胞DNA的完整性进行检测,并用比色法对红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及肝匀浆丙二醛(MDA)含量进行测定。结果:各照射剂量组小鼠组织细胞拖尾率和拖尾细胞尾长比对照组显著增加(P<0.05),并呈现良好的剂量反应关系。7Gy剂量组小鼠红细胞SOD活性及全血GSH-Px活性明显低于对照组(P<0.05),而肝匀浆MDA含量则明显高于对照组(P<0.05)。结论:60Coγ射线照射可造成小鼠多组织细胞DNA完整性的损伤,破坏组织抗氧化系统并引起脂质过氧化水平增高。

DNA氧化损伤修复基因HOGG1低表达细胞株的建立及其生物学特性鉴定

目的为研究肺癌发生机制中DNA氧化损伤修复基因HOGG1的可能作用,利用携带有HOGG1特异性锤头状核酶基因的载体与肺腺癌A549细胞株,建立HOGG1低表达细胞株并观察其生物学效应。方法HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体[pcDNA3.1(+)RZ]经脂质体介导转染A549细胞;G418筛选;Neo基因的RTPCR法鉴定阳性克隆细胞;RTPCR半定量检测核酶对HOGG1基因的抑制效应。同时比较转染细胞与正常A549细胞的生长情况、细胞周期、软琼脂克隆形成率以及超氧化物歧化酶(SOD)的活力。结果转染后G418成功筛选出了阳性转化克隆,经传代形成稳定细胞株。核酶可持续抑制A549细胞HOGG1基因的表达,RTPCR结果显示转染细胞HOGG1mRNA的表达比正常A549细胞低61.5%(P<0.05);转染后,细胞株形态无明显改变;其群体细胞倍增时间为2.05天,稍短于正常A549细胞(2.17d);细胞周期各时相及细胞凋亡率以及细胞增殖指数没有明显改变(P>0.05);软琼脂克隆形成抑制率接近50%(P<0.05);SOD活力比正常A549细胞显著增加(P<0.05)。结论成功建立HOGG1低表达细胞株,所观察的生物学效应多数指标与正常A549细胞无显著差异。

磺胺二甲嘧啶对FRTL-5细胞合成、分泌甲状腺球蛋白的影响

[目的 ]研究磺胺二甲嘧啶对FRTL 5细胞株合成、分泌甲状腺球蛋白的影响 ,并探讨FRTL 5细胞株用于筛选环境甲状腺素干扰物的可能性。 [方法 ]FRTL 5细胞分别经 0 .5、1.0、2 .0、4.0、和 8.0 μg/ml磺胺二甲嘧啶染毒处理48h后 ,用MTT实验检测磺胺二甲嘧啶对细胞活力的影响以确定染毒浓度 ;以MTT实验最大无作用浓度作为最高染毒浓度 ,另设中、低浓度共 3组染毒细胞 ,用放射免疫法测定染毒 48h后培养液中细胞分泌甲状腺球蛋白的浓度 ;用活细胞爬片的免疫组化染色观察最高浓度处理组细胞胞质中合成甲状腺球蛋白的表达水平 ,并用透射电镜观察细胞的超微结构。[结果 ]根据MTT实验 ,确定染毒浓度为 0 .5、1.0和 2 .0 μg/ml,随磺胺二甲嘧啶浓度的增大 ,FRTL 5细胞培养液中甲状腺球蛋白的浓度逐渐降低 ,其中 1.0 μg/ml浓度组与对照组相比差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ,2 .0 μg/ml浓度组培养液中未能检出甲状腺球蛋白 ;免疫组化染色可见染毒组细胞胞质中合成的甲状腺球蛋白表达显著减弱 ,图像分析结果显示其灰度值的差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;细胞超微结构观察发现染毒组细胞出现粗面内质网扩张。 [结论 ]通过损伤甲状腺滤泡细胞的粗面内质网 ,而影响甲状腺球蛋白的合成与分泌 。

hOGG1基因低表达对DNA氧化损伤及修复的影响初探

背景与目的:初步探讨采用核酶技术获得的hOGG1基因低表达的细胞对氧化剂诱导的DNA氧化损伤与修复作用的影响。材料与方法:以A549细胞和通过稳定转染hOGG1核酶而获得的hOGG1低表达的A549_R细胞为研究对象,分别以重铬酸钾和过氧化氢为受试物,比较两种细胞DNA损伤与修复的差异。彗星试验检测不同浓度受试物作用下两种细胞的彗星细胞率和DNA迁移长度;改良彗星试验比较两种细胞在去除受试物后孵育0、30、60、120和180min时的修复情况。结果:重铬酸钾和过氧化氢对A549_R细胞的DNA损伤效应敏感,在一些浓度下其彗星细胞率和DNA迁移长度明显高于A549细胞(P<0.05);A549_R细胞的DNA修复能力显著低于A549细胞(P<0.05)。结论:hOGG1基因的低表达可以增加细胞对氧化剂诱导的DNA损伤的敏感性,降低细胞DNA的修复能力。

香烟烟雾对2种肺细胞的DNA损伤与修复

目的探讨经香烟烟雾溶液染毒的人正常肺间质细胞和人肺腺癌细胞的DNA损伤及其修复效应。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(HLF)和人肺腺癌A549细胞,以二甲基亚砜(DMSO)和磷酸缓冲液(PBS)作为吸收液,采集香烟主流烟雾。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定香烟烟雾-DMSO吸收液和香烟烟雾-PBS吸收液(分别简称DMSO烟液和PBS烟液)的1/2、1/4、1/8和1/16倍稀释液和原液对HLF细胞和A549细胞的毒性(分别以DMSO和PBS为阴性对照),以无明显细胞毒性的浓度进行彗星实验(分别以DMSO和PBS为阴性对照,以重铬酸钾为阳性对照),测定细胞的DNA损伤及修复情况。结果DMSO烟液原液及其1/2稀释液染毒的细胞存活率低于80%,而PBS烟液染毒的细胞存活率均高于80%。DMSO烟液的1/4、1/8、1/16倍稀释液以及PBS烟液的1/2、1/4、1/8和1/16倍稀释液和原液对HLF细胞和A549细胞的DNA损伤与阴性对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01),且存在明显的剂量-效应关系。DNA损伤在两种细胞间差异无统计学意义(P>0.05),但DMSO烟液所致的DNA损伤高于PBS烟液(P<0.01)。细胞在去除受试物后培养30min时开始修复,随着修复时间的延长,拖尾细胞数减少,DNA迁移长度缩短(P<0.05),且A549细胞修复得更快(P<0.05)。结论DMSO烟液的细胞毒性和遗传毒性均高于PBS烟液。香烟烟雾对HLF细胞和A549细胞的DNA损伤差异不明显,A549细胞的DNA损伤修复能力较HLF细胞强。

C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞的体外优化培养和酒精及其代谢物毒性效应的探讨

目的建立C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)的体外分离和培养体系,探讨酒精及其代谢物对MSCs的毒性。方法从C57/BL6小鼠的股骨骨髓中分离MSCs,通过优化细胞的培养方法进行有效培养、传代,最终获得纯度较高的MSCs,并对第4代细胞进行CD90和CD34免疫组织化学染色鉴定。对第2代细胞以4×105个/ml密度接种于96孔板,每孔200μl,第2天以用乙醇及乙醛进行染毒,剂量设计为乙醇5.7、17.0、50.0、100.0、150.0mmol/L,乙醛4.5、0.9、0.18、0.036、0.0072、0.00144、0.000288mmol/L,对照组为MSCs以不加乙醇及乙醛的10%胎牛血清的α-MEM培养液培养。3d后MTT检测细胞增殖活性。结果MSCs在前6代表现出较好的稳定性和旺盛的自我增殖能力,免疫组织化学染色显示第4代MSCsCD90呈阳性、CD34呈阴性。MTT检测乙醇在17.0、100.0及150.0mmol/L时出现细胞增殖抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);乙醛>0.18mmol/L时随着浓度增加细胞增殖力减弱,在4.5mmol/L时出现了细胞增殖抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论优化培养体系能有效分离和培养MSCs,乙醇和乙醛均能抑制其增殖,表现出毒性作用,乙醛的毒性作用较乙醇强,其造成的损伤更不容忽视。

汽油尾气对小鼠肺脏的氧化应激和遗传毒性作用

[目的]探讨汽油尾气对小鼠肺的氧化应激作用和对脏器系数以及组织细胞DNA的影响。[方法]将汽油尾气有机提取物以0、8.5、17.0、34.0 L/kg的剂量经气管滴注染毒昆明种小鼠,每5 d染毒1次,共3次,末次染毒24 h后处死小鼠,称量体重和肺脏重量,测定肺组织内超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量;并用彗星实验检测肺组织细胞中DNA的损伤程度。[结果]各剂量组小鼠肺脏脏器系数的增加与对照组相比差异无统计学意义(P﹥0.05);各剂量组SOD和GSH-Px酶活力明显降低,MDA含量则显著升高(P﹤0.05),且染毒剂量与酶活力、MDA含量均呈剂量-反应关系(r值分别为-0.98、-0.959和0.97,P均小于0.05)。在17.0、34.0 L/kg组,肺组织细胞的拖尾率和尾长较对照组明显增加(P﹤0.05)。[结论]汽油尾气可促进小鼠肺组织的氧化应激和诱导肺细胞DNA的损伤。

彗星试验非荧光染色研究

目的为了建立一种非荧光染色的彗星试验。方法将Feulgen法、甲基绿染色法、全染料 (stains_all)法和银染法等几种非荧光DNA特异染色方法试用于彗星试验 ,并与溴化乙锭 (EB)染色进行了比较。结果在所试验的染色法中 ,仅银染法有满意的效果 ,染色清晰 ,“彗星”头和尾的边界易于判断 ,染色持久 ,敏感性高 ,可染出EB不能染出的DNA小片段 ,得到“彗星”头长和尾长均为EB染色的2倍以上 ,安全、价廉。结论银染法摒弃了EB染色的不足 ,在彗星试验中可以替代EB染色 ,为彗星试验的进一步推广提供了可能。

农药叶枯宁对大鼠血清甲状腺素水平影响的时效关系

[目的 ]研究甲状腺素干扰物叶枯宁对大鼠血清游离T4(FT4)和促甲状腺激素 (TSH)水平的影响及其时效关系 ,为建立甲状腺素干扰物甄别方法体系的体内方法提供实验依据。 [方法 ]叶枯宁二甲亚砜溶液灌胃染毒 ,剂量为 5 0mg/kg ,分别设 5、6、10、2 0d实验组及溶剂对照组 ,在染毒期满后处死动物 ,取血清测FT4和TSH ,同时观察甲状腺组织学改变。 [结果 ]与对照相比 ,5d组出现显著的FT4降低并伴TSH升高 (P <0 0 5 ) ,6d及以后组则未见差异 ;组织学观察到 5d、6d组甲状腺滤泡上皮增生 ,10d组出现实心芽 ,2 0d组出现实心继发滤泡。 [结论 ]叶枯宁对大鼠血清FT4和TSH水平的影响发生在 5d之内 ,并可继发引起甲状腺增生。