绿色荧光蛋白标记对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响

目的:观察腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白对骨髓间充质干细胞的标记效率及标记对骨髓间充质干细胞生长的影响,为进一步追踪研究骨髓间充质干细胞奠定基础。方法:实验于2006-11/2007-03在四川大学华西组织胚胎学与神经生物学实验室完成。①实验材料:成年雄性SD大鼠,体质量100～120g,由四川大学实验动物中心提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,应用免疫细胞化学方法对培养的骨髓间充质干细胞进行鉴定。将生长到约80%融合的第3代骨髓间充质干细胞随机分为绿色荧光蛋白标记组和对照组。绿色荧光蛋白标记组加入1:100稀释的腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack-CMV)上清液,对照组加入磷酸盐缓冲液。③实验评估:观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞生长曲线的影响。结果:体外培养的原代骨髓间充质干细胞24h内可见有少量贴壁细胞,8～10d左右达到70%～80%汇合。免疫细胞化学检测第3代骨髓间充质干细胞显示,CD44和CD90表达阳性,而CD14和CD34表达阴性。生长曲线表明,绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞增殖无明显影响。结论:腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞效率高,标记后对细胞的生长无明显影响。

Ⅰ型胶原基因启动子区-1997G/T位点多态性和成都地区汉族绝经后妇女骨密度的相关性研究

目的研究Ⅰ型胶原α1链(COLⅠA1)基因启动子区-1997G/T位点多态性与成都地区汉族绝经后妇女腰椎骨密度的相互关系。方法根据双能X线吸收法测定第2～4腰椎(L2～4)部位的骨密度值的结果,纳入受试者318例,均为成都地区汉族绝经后妇女,其中骨质疏松症组212例,正常对照组106例;抽取受试者外周静脉血2 mL,提取白细胞基因组DNA;采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因所在的DNA片段;应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测外周血白细胞基因组COL1A1基因启动子区-1997G/T位点多态性。结果骨质疏松症组中COLⅠA1基因启动子区-1997G/T位点GG、GT、TT基因型分别有82例、99例和31例,对照组中GG、GT、TT基因型分别有51例、45例和10例;骨质疏松症组的COLⅠA1基因启动子区-1997G/T位点等位基因T的频率较正常对照组高(P<0.05);对骨质疏松症组按基因型分组进一步分析发现,TT纯合子组个体的腰椎骨密度比GG纯合子组和GT杂合子组低(P<0.05)。结论COLⅠA1基因启动子区-1997G/T位点多态性与成都地区汉族绝经后妇女腰椎骨密度相关,携带TT基因型的个体更易导致低骨矿密度和患骨质疏松症。

应用竞争性荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的:建立竞争性荧光定量聚合酶链反应(CFQ-PCR),并探讨CFQ-PCR在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义.方法:根据HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,和一条特异的TaqMan探针;根据上述引物序列,采用分子克隆技术制备内对照DNA;再根据内对照序列合成一条内对照DNA特异的与上述TaqMan探针不同标记的TaqMan探针;将适量的内对照DNA加入到PCR反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增.结果:在30μL CFQ-PCR反应体系中,加入约20拷贝内对照DNA能够稳定地获得共扩增曲线;经琼脂糖凝胶电泳分析,加入约100-500拷贝内对照DNA能够有效地获得共扩增产物条带信号;在210个临床HBsAg阳性血清标本的CFQ-PCR扩增中识别出8个未能有效扩增的标本,60份HBsAg阴性血清标本中识别出2个内对照未能有效扩增的标本,后经DNA纯化处理,上述全部标本的内对照均获得阳性扩增结果,其中有7个HBsAg阳性血清标本获得HBV DNA扩增阳性结果.结论:CFQ-PCR能够有效地提示临床标本HBV DNA体外扩增时由于扩增失败导致的假阴性,适合临床推广应用.

Ⅰ型胶原α_1链基因-1997G→T突变对成骨细胞生物学性能的影响

目的研究Ⅰ型胶原α1链(COLⅠA1)基因-1997G→T突变对成骨细胞生物学性能的影响,初步探讨COLⅠA1基因-1997G/T多态性影响骨矿物密度(BMD)的病理机制。方法取行髋、膝关节置换患者的松质骨原代培养成骨细胞,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对成骨细胞进行基因型鉴定,筛选出GG、GT、TT三个基因型的细胞株,实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测COLⅠA1 mRNA表达量;ELISA法测其合成Ⅰ型胶原的量;并测成骨细胞增殖率、骨碱性磷酸酶(BALP)的活性、细胞基质钙含量以及钙结节数量。结果成功筛选出GG、GT、TT三个基因型的成骨细胞株。TT型成骨细胞的COLⅠA1 mRNA表达量、Ⅰ型胶原含量、细胞基质钙含量以及钙结节数量均低于GG、GT型(P<0.01),GT型与GG型之间差异无统计学意义(P>0.05)。而年龄、细胞增殖率、BALP活性三个基因型的成骨细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 COLⅠA1基因-1997G→T突变可减少成骨细胞COLⅠA1 mRNA表达量、Ⅰ型胶原的含量、细胞基质钙含量以及钙结节数量。TT型成骨细胞Ⅰ型胶原合成的减少导致细胞外基质减少,钙质沉着部位不足可能是-1997G/T患者BMD降低的原因。

大鼠BMSCs体外诱导培养后连接蛋白40及超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4表达的初步研究

目的观察大鼠BMSCs与窦房结组织块混合诱导培养后连接蛋白40(connexin 40,Cx40)及超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4,HCN4)的表达情况,探讨大鼠BMSCs向窦房结细胞诱导分化的可能性。方法 4～6周龄SD大鼠20只,雌雄不限,体重200～300 g。取6只SD大鼠,采用贴壁筛选法分离BMSCs,取第3代细胞以羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯标记后,接种于6孔培养板内,同时制作细胞爬片。取14只SD大鼠窦房结组织,剪成0.3 cm×0.3 cm大小组织块,与标记后的第3代BMSCs混合培养,作为实验组;对照组仅单独培养第3代BMSCs。对照组培养1周及实验组混合培养1、2、3周,采用免疫组织化学方法检测Cx40和HCN4表达,并采用Image pro plus 5.0图像分析软件检测各组细胞表达Cx40和HCN4的平均积分吸光度值(mean integrated absorbance,MIA);采用实时荧光定量PCR检测细胞Cx40及HCN4 mRNA表达水平。结果免疫组织化学染色检测示,实验组混合培养1、2、3周,Cx40和HCN4 MIA值均显著高于对照组(P<0.01);且实验组随培养时间延长,Cx40和HCN4MIA值均逐渐增加,各时间点间差异均有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量.PCR检测示,实验组混合培养后1、2、3周,Cx40和HCN4 mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.01);实验组随培养时间延长,Cx40和HCN4 mRNA表达水平均逐渐增加,各时间点间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论将大鼠BMSCs与窦房结组织块体外混合培养,诱导后细胞高表达Cx40及HCN4,具有向窦房结细胞分化的可能。