HNP-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

目的筛选胎肾上腺cDNA文库中与人中性粒细胞多肽(HNP-3)成熟肽具有相互作用的蛋白分子。方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功获得HNP-3成熟肽基因,并将其插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转染酵母细胞AH109,而后经缺陷性培养基上培养并观察pGBKT7-HNP-3在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。同时收集胎肾上腺,提取RNA,通过自我检测、分析、报告技术(SMART技术)制备人胎肾上腺cDNA文库。并采用Match-maker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-3成熟肽相互作用的蛋白。最后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,通过回转实验,谷胱甘肽巯基转移酶沉降技术(GST pull down)以及免疫共沉淀实验再次验证二者的相互作用关系。结果成功构建诱饵质粒pGBK-T7-HNP-3以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-3成熟肽相互作用的蛋白——促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)2、钙粘着蛋白关联蛋白1(CTNNB1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、成对样同源域转录因子2(PITX2)等。最终选定ACTH-R作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实二者间具有相互作用的相应的条带。结论从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-3成熟肽相互作用蛋白——ACTH-R。

用于酵母双杂交的α-防御素HNP-1成熟肽重组诱饵载体的构建和鉴定

目的:构建和转化人α-防御素HNP-1成熟肽的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究其相互作用蛋白分子打下基础。方法:用RT-PCR扩增HNP-1成熟肽基因,将该基因片断与腺病毒载体pBluescript-SK-II定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;回收目的片断,将其连接入酵母表达载体pGBKT7,构建重组诱饵表达质粒pGBKT7-HNP-1,测序鉴定。缺陷培养方法检测重组诱饵载体有无毒性和自激活作用。结果序列分析表明HNP-1成熟肽重组诱饵表达质粒构建成功,重组诱饵表达质粒对酵母细胞无毒性作用,无自激活效应发生。结论构建用于酵母双杂交的α-防御素HNP-1成熟肽重组诱饵载体,为找出与人α-防御素HNP-1成熟肽相互作用蛋白分子打下了基础。

腹腔注射乳化异氟醚对大鼠气道上皮组织β防御素mRNA表达的影响

目的本研究旨在探讨腹腔注射乳化异氟醚对大鼠气道上皮细胞中β防御素BD-1、BD-2以及促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8 mRNA表达水平的影响。方法健康清洁级SD大鼠36只随机分成6组,分别为A^F组。A组经腹腔注射生理盐水,B组经腹腔注射30%脂肪乳,C^F组分别经腹腔注射0.25、0.5、1.0、1.5倍ED50量8%乳化异氟醚。各组均于注药后1 h处死大鼠,取其气管黏膜组织。从每个组收获的组织中检测β防御素BD-1、BD-2和促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8的mRNA表达水平。结果在腹腔注射乳化异氟醚的大鼠气管上皮组织中除BD-1和IL-8 mRNA无变化外,BD-2和促炎症因子TNF-α,IL-1βmRNA表达水平均增加,且随乳化异氟醚用量的增加而增强。结论本实验说明腹腔注射乳化异氟醚能在转录水平上调节大鼠气道上皮组织β防御素及一些促炎症因子mRNA的表达水平,且乳化异氟醚以剂量依赖的方式显著增加大鼠气道上皮细胞的β防御素BD-2以及这些促炎症因子mRNA的表达水平。