高水平医学研究生科研培训基地建设创新模式——以四川大学华西医院为例

临床研究生如何快速进入科学研究领域,独立开展科学研究,是目前国内医学研究生教育的一个普遍性难题。近年来,各类大型医院特别是教学型综合医院开始重点建设各类公共开放实验技术平台,这为提高医学研究生的科研能力提供了重要场所与切入途径。华西医院公共实验技术中心根据医学研究生培养的科研需求,通过提供安全可靠、技术针对性强的实验技术培训,并结合"个性化"的加强式培训及前沿技术讲座,形成了一系列技术理论与实践相结合的创新培训模式。这些模式可为国内高等院校和医院等单位在建设公共实验平台中提供有益的参考。

以公共科研平台及临床学科研究室建设促进医院学科发展

建立公平可及、高效可靠的公共科研平台,以临床学科或亚专业为导向建设归属临床科室的临床学科研究室,是满足医院不同层次实验需求、有效促进基础研究与临床学科真正结合的关键。以四川大学华西医院为例,介绍了建立不同类型的公共平台,建设归属临床科室的临床学科研究室,培养高素质技术人员,再借助公共平台的技术支持推动临床学科发展的模式。

综合医院科研公共平台入室人员管理规范

随着国家对教育和科技的重视,越来越多的高校建立了公共实验平台,国内现有公共实验平台主要集中了大型仪器设备,为师生提供贵重仪器设备的开放服务。通过分析大型综合医院科研公共平台入室人员的特征及现状,以四川大学华西医院公共实验技术中心为例,从入室人员入室流程规范、信息化管理、积分制度、多形式培训、资源共享等角度阐述对入室人员的管理,旨在提高管理效率、营造实验室安全氛围、提高入室人员科研技术能力、促进资源最大化利用。

科研实验技师规范化培训体系的探索与建立

生物和医学类实验室技术人员在综合性医院发挥了重要作用。为使华西医院成为我国一流综合型医院,进行了科研实验技师规范化培训体系的建立与探索。在十年的摸索中,确定规范化培训任务,组织高素质的教师队伍,建立培训平台,制定标准化培训计划,从知识,技能和态度方面系统评估培训学员的素养。系统化和规范化培养具有职业素质、扎实实验理论和规范操作技能的实验技术人员对科学研究发展至关重要。

嗜铬细胞瘤/副神经节瘤诊疗的研究进展

嗜铬细胞瘤/副神经节瘤(PPGL)是罕见的神经内分泌肿瘤。近年来,多模态影像组学、病理组学、基因组学、转录组学、表观遗传组学、代谢及蛋白组学等领域不断发展为我们更好地理解PPGL的复杂转移机制提供了思路。本文就PPGL的精准分型体系、现阶段各组学诊断研究进展以及临床预后作一综述。

尿道悬吊术治疗前列腺切除术后男性尿失禁的研究进展

前列腺切除术后的压力性尿失禁(SUI)是男性人群的一个重要且普遍的问题,会显著降低患者生活质量。尿道悬吊术是男性SUI的一种深具潜力的治疗方法,其操作便捷并避免插入假体,患者接受度较高。近年来随着技术的进步,多种悬吊装置相继投入临床应用并取得了较好疗效。本文就尿道悬吊术在前列腺切除术后SUI治疗中的应用研究作一综述。

基于层次分析法构建大型科研仪器设备申购论证评价体系研究

目的:构建大型科研仪器设备申购论证评价指标体系,为大型科研仪器设备准入评估提供技术支撑。方法:通过专家评估和问卷调查,确定评价指标体系的一级指标和二级指标,利用层次分析法(AHP)计算各级指标权重,构建设备论证评价指标体系。以医院申购的高分辨小动物活体成像系统、超高分辨质谱和激光共聚焦拉曼光谱仪3种类型大型科研仪器设备论证评价为案例,对各指标的相对重要性进行评分,并对其指标体系实例论证评估。结果:大型科研仪器设备申购论证评价指标包括申购必要性、设备合理性、配套条件及预期效益4个一级指标和16个二级指标。3种类型的大型科研仪器设备申购论证中,公共平台申购的超高分辨质谱和激光共聚焦拉曼光谱仪得分>7分,专家予以论证通过,与设备调研情况符合度高。结论:大型科研仪器设备申购论证评价指标体系可有效提高科研仪器设备采购的科学性,为优选设备提供定量依据,实现大型科研仪器设备的合理购置。

葫芦素I(JSI-124)通过p53信号通路诱导HepG2细胞凋亡

目的研究葫芦素I(cucurbitacin I,JSI-124)诱导HepG2人肝癌细胞凋亡的机制。方法用(0.01、0.10、1.00、10.00)μmol/L JSI-124分别处理培养的HepG2细胞24、48、72 h,CCK-8法检测细胞增殖,Hoechst33258染色法观察细胞核形态变化,克隆形成实验观察集落形成能力变化,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡情况,实时定量PCR检测p53及其下游Bax、Fas、鼠双微体基因2(MDM2)的mRNA表达变化,Western blot法检测P53及活化caspase-3的蛋白表达变化。结果JSI-124呈浓度和时间依赖性地抑制HepG2细胞的增殖。Hoechst33258染色法显示JSI-124呈剂量及时间依赖性引起HepG2细胞核染色质的凝集。与对照组相比,流式细胞术检测结果表明1μmol/L JSI-124处理的HepG2细胞凋亡率明显增加。JSI-124显著增强p53及受其调控的下游促凋亡因子Bax和死亡受体Fas mRNA的表达,而与p53结合并抑制p53功能的MDM2的mRNA表达变化不明显。JSI-124处理HepG2细胞48 h后,p53及活化的caspase-3蛋白显著增加。结论 JSI-124通过p53及其下游的促凋亡因子诱导HepG2人肝癌细胞发生凋亡。

柴胡皂苷D对H2O2诱导大鼠心肌细胞H9c2损伤保护机制研究

目的探讨柴胡皂苷D对H2O2诱导大鼠心肌细胞H9c2损伤保护作用及机制。方法培养H9c2细胞,利用H2O2(400μM,4h)建立心肌细胞损伤模型。设立空白对照组、心肌损伤模型组(H2O2组)、柴胡皂苷D组(4μM),加入柴胡皂苷D预作用3h后,换成含浓度为400μM H2O2的完全培养基,继续培养4h后,应用多功能酶标仪检测细胞内活性氧水平,Hoechst 33258染色、流式细胞仪检测细胞凋亡变化,利用检测试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量,同时利用荧光定量PCR(real-time PCR)技术检测过氧化物酶体增殖子活化受体(PPARγ)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)基因水平的表达变化。结果 Hoechst 33258染色和流式细胞检测结果显示:与对照组比较,H2O2组凋亡细胞升高,而柴胡皂苷D组的凋亡细胞量明显少于H2O2组(均P<0.05);细胞内活性氧(ROS)含量检测结果显示:H2O2组的细胞内ROS含量明显高于对照组,而柴胡皂苷D组明显低于H2O2组(均P<0.05);与对照组比较,H2O2组细胞LDH、MDA含量明显升高,柴胡皂苷D组细胞LDH、MDA含量明显降低(均P<0.05);柴胡皂苷D组的PPARγ、Nrf2、HO-1在m RNA水平的表达较H2O2组升高(均P<0.05)。结论柴胡皂苷D能够降低H2O2诱导H9c2心肌细胞产生的氧化应激反应,对心肌细胞具有保护作用。

一种肠类器官样本快速石蜡块的制作方法

类器官于2009年由Sato等[1]首次报道,其能较好地模拟体内细胞三维生长的生理条件,目前已广泛应用于疾病的研究并成为最具前景的实验技术。肠道病理的药理学、毒理学或微生物研究中常采用人或小鼠肠道组织进行肠类器官培养[2]。肠类器官培养成为研究和治疗肠道疾病可行的方法[3],也是一种全新的消化道疾病体外研究模型。

大鼠心肌细胞H9C2活性氧水平检测方法探究

目的比较3种细胞内活性氧(ROS)的检测方法,分析优缺点,筛选1种合适、准确的检测大鼠心肌细胞H9C2缺氧/复氧(H/R)模型中细胞内活性氧的方法。方法培养H9C2细胞,选择密度合适(80%~90%)的H9C2细胞进行铺板,加入2,7-双乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)荧光探针孵育,应用荧光显微镜、流式细胞仪及荧光酶标仪3种方法检测对照组(正常含氧量培养条件,CON)和实验组(缺氧复氧处理,H/R6h)心肌细胞的荧光强度,从而反映大鼠心肌细胞内活性氧水平,并利用数据分析软件进行统计分析。结果流式细胞仪检测分析结果:对照组(152 690±34 104)FU/μg,实验组(325 669±12 755)FU/μg;荧光酶标仪检测分析结果:对照组(282.3±12.57)FU/μg,实验组(1 274±37.05)FU/μg。实验组的ROS水平与对照组的ROS水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),实验组高于对照组,而荧光显微镜观察法无法定量地分析出实验结果。结论 3种ROS检测方法中,荧光酶标仪检测方法能更好地判断大鼠心肌细胞H9C2活性氧水平。

成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性

目的:建立一种周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法,并探索其生物学特性。方法:取8~12周龄BALB/c小鼠背部、尾尖、耳部皮肤,配制2种血清的细胞培养液,采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养,通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度;通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别。结果:背部皮肤组织块贴壁使用Gibco胎牛血清培养7 d无细胞游出,CLARK特级胎牛血清细胞游出较多。背部皮肤经酶消化法得到细胞贴壁少;经组织块贴壁法细胞生长慢,培养周期长;酶消化组织块贴壁法细胞游出速度快、数量多、呈长梭形。尾尖取材量少,得到细胞少;耳部皮肤取材方便,但细胞纯度低。CCK8增殖曲线呈S型;相较于对照组,UVB辐照后细胞凋亡率增高17%。结论:CLARK特级胎牛血清、背部皮肤取材、酶消化组织块贴壁法是培养成年小鼠原代皮肤成纤维细胞最优的方案,可增加细胞得量、缩短培养周期,降低成本。

PDE5抑制剂与黑色素瘤风险的相关性研究进展

5型磷酸二酯酶抑制剂(PDE5抑制剂)是治疗勃起功能障碍的首选药物,其通过选择性抑制PDE5的活性,减少cGMP的降解,扩张阴茎海绵体血管,从而维持男性勃起反应。目前,部分基础研究表明PDE5抑制剂的作用机制可能会影响皮肤细胞的信号通路,导致患者黑色素瘤的风险增加。此外,较多临床研究也对PDE5抑制剂和黑色素瘤发病风险的相关性进行了评估,但目前尚未得出明确一致的结论。本文就上述研究进展进行综述。

microRNA-193b和microRNA-141在脓毒血症休克小鼠基因启动子区的甲基化状态

为了探究microRNA-193b和microRNA-141在脓毒血症休克小鼠的受累器官的基因启动子区甲基化及病理生理学意义,利用盲肠结扎穿刺(CLP)小鼠脓毒血症休克晚期模型,采用多导生理仪检测心功能,自动生化仪检测血糖和血乳酸水平,亚硝酸氢盐测序(BSP法)分别检测小鼠心脏、肝脏、肺及小肠的microRNA-193b和microRNA-141的基因启动子区甲基化。microRNA-193b基因克隆测序结果表明,休克晚期小鼠心脏组织其CpG岛的甲基化程度明显升高,甲基化频率为23.9%,高于正常组1.9%(P<0.05);microRNA-141基因克隆测序结果显示,休克晚期小鼠肺、小肠组织其CpG岛的甲基化程度明显升高,甲基化频率分别为31.2%和36.9%,高于正常组织3.4%(P<0.01)和4.6%(P<0.01)。结果表明在脓毒血症休克时,小鼠出现心功能障碍和代谢紊乱,microRNA-193b和microRNA-141的基因启动子区CpG岛甲基化,这可能是microRNA-193b和microRNA-141的表达水平变化的原因,并提示它们可能通过调节下游炎症相关靶蛋白的表达,继而调节感染性休克的病理生理过程。microRNA-193b和microRNA-141可能为感染性疾病早期诊断、治疗的新标志物和新靶点。

垂体中叶素抑制内质网应激拮抗阿霉素诱导的H9c2心肌细胞损伤机制研究

目的利用阿霉素(doxorubicin,DOX)诱导的H9c2心肌细胞损伤模型研究垂体中叶素(intermedin,IMD)拮抗DOX心脏损伤的药理学作用和机制。方法建立H9c2细胞的DOX心脏损伤模型,设空白对照组、DOX(2μmol/L)模型组、IMD受体拮抗剂IMD17-47(1μmol/L)组和IMD8-47(10^(-8)、10^(-6)和10^(-5)mol/L)3个剂量处理组,采用CCK-8法检测心肌细胞活性,丙二醛(MDA)含量测定评价H9c2细胞的氧化应激水平,Western法检测caspase-3活化片段和内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GPR78)的表达水平,并采用Real-time PCR法检测内源性IMD及其受体系统的mRNA表达水平。结果与对照细胞相比较,DOX处理显著降低细胞存活率、增加细胞内MDA含量、caspase-3活性片段和内质网应激水平。与单纯DOX组相比较,IMD17-47抑制DOX诱导的内源性IMD的作用后明显降低细胞的存活率(P<0.05)、增加细胞内MDA含量(P<0.01)、caspase-3活化片段和内质网应激水平(P<0.01);外源性给予IMD干预呈剂量依赖性地促进DOX处理细胞的存活率、降低细胞的MDA含量、凋亡和内质网应激水平(P<0.05)。此外,DOX处理明显增加心脏组织内源性IMD及其受体的mRNA表达。结论 DOX诱导心肌细胞内源性IMD及其受体的表达,内源性IMD和外源性给予的IMD均通过DOX刺激增强的IMD受体系统,有效降低DOX诱导的氧化应激和内质网应激水平,实现其促进心肌细胞存活、抑制细胞凋亡的保护作用。

3种转染试剂在SKOV3细胞中转运大质量质粒的效率比较

以pAdeasy-1-EGFP作为外源转入质粒,表达绿色荧光蛋白的融合基因,分别用3种转染试剂Lipofectamine 3000、DNA-In CRISPR和FuGENE HD转染SKOV3细胞,比较3种转染试剂在SKOV3细胞中转染大质量质粒的转染效率,以此选择合适的转染试剂解决携带大片段质粒转染效率低的问题。通过观察GFP绿色荧光评估转染效率,并用CCK8法测定3种转染试剂对细胞存活率的影响。实验结果显示Lipofectamine 3000转染效率大于50%,FuGENE HD转染效率约20%,DNA-In CRISPR的转染效率小于5%。Lipofectamine 3000转染SKOV3细胞24 h后细胞活性达到(97.5±2.52)%,FuGENE HD和DNA-In CRISPR转染试剂的细胞活性分别为(89.5±2.43)%和(95.5±3.48)%。对比分析表明,转染试剂Lipofectamine 3000转染效率较高且细胞毒性低,适用于SKOV3细胞进行大质量质粒的转染。

人G蛋白偶联受体91(hGPR91)在HEK293细胞的表达

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCR）是一大类通过G蛋白介导其生物效应的膜受体总称,它可与多种细胞外信号分子结合,导致其胞内第二信使改变,引起相应的生物效应。GPCR也是最大的膜受体家族,大概有800种,且约80%的跨膜信号转导需要借助GPCR来完成,其成员均参与广泛的病理生理过程。

一种用于肌腱二级纤维束及周围腱内膜形态观察的扫描电镜制样方法研究

目的探讨一种用于肌腱二级纤维束及周围腱内膜形态观察的扫描电镜制样方法。方法以猪趾浅屈肌腱为例,将肌腱在常温下横切为1 cm左右的肌腱段,通过双光子荧光显微镜观察组织完整性,行冰冻切片联合特殊Masson染色,观察肌腱二级纤维束及周围腱内膜分布情况。另取肌腱段若干经10%中性甲醛固定4 h,分为5组,采用不同的扫面电镜制样方法:A组,单纯梯度脱水;B组,行冰冻切片,再将肌腱切片进行梯度脱水;C组,梯度脱水至70%,行冰冻切片,再将肌腱切片进行梯度脱水;D组,梯度脱水至80%,行冰冻切片,再将肌腱切片进行梯度脱水;E组,梯度脱水至100%,行冰冻切片。各梯度脱水试剂为乙醇配制,梯度脱水终浓度均为100%。冰冻切片厚度均为100μm。经临界点干燥喷金后行体视显微镜和扫描电镜观察。结果双光子二次谐波显微成像观察示肌腱结构完整连续。Masson染色观察示周围腱内膜较薄区域难以辨别独立胶原纤维束。体视显微镜观察示肌腱切片电镜制样后大体完整,三级纤维束的周围腱内膜清晰可见。扫描电镜观察示A、D、E组肌腱组织呈现不同程度的过度收缩,二级纤维束结构无法辨别;B组整体呈现无规律的冰晶空隙,二级纤维束结构难以辨认,胶原纤维排列清晰可见;C组连续完整,二级纤维束及其周围腱内膜、胶原纤维排列均清晰可见。结论扫描电镜的肌腱试样制备,可通过组织固定后经乙醇梯度脱水至70%,行冰冻切片,再将肌腱切片继续梯度脱水至100%,该方法能清晰观察到肌腱二级纤维束及周围腱内膜的形态。

一种高扩展性的设备管理系统设计与实现

在某科研单位的设备使用场景及实际需求背景下,为了实现设备的灵活管理与流程管理,介绍了一种基于B/S模式的可扩展性较高的设备管理系统的设计及实现方式。系统通过Microsoft Visual Studio.NET平台技术,利用C#语言与SQL Server数据库,最终实现了操作方便、扩展容易、数据传输可靠的以WEB进行数据录入及查询的设备管理系统。实际使用证明,该系统极大地提高了设备管理的工作效率,并且通过扩展性设计极大地延长了系统的生命周期。

白藜芦醇对于小鼠败血症休克的保护作用及其作用机制的研究

目的从动物休克模型和细胞水平上研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对败血症的调节作用及其分子药理学作用机制。方法通过建立小鼠盲肠结扎穿孔诱导的败血症休克模型(CLP),研究白藜芦醇给药后的小鼠的存活率。然后利用体外培养的心肌细胞建立LPS损伤模型,采用反转录PCR(RT-PCR)、Real-time PCR检测细胞内源性TNF-α、SIRT1等的mRNA的表达水平,Western blot分析NF-κB重要亚基的蛋白表达水平。结果与单纯休克模型组相比较,腹腔注射白藜芦醇(1和5 mg·kg-1·d-1)治疗明显增加败血症休克小鼠的存活率;白藜芦醇处理明显促进SIRT1、SIRT6和SIRT7的mRNA表达,抑制LPS诱导的NF-κB核转位。结论适当剂量的白藜芦醇可能通过上调SIRT家族成员,并抑制NF-κB炎症反应通路,对败血症休克具有潜在的药理学保护作用。