雪旺细胞纯化培养及体外复合猪小肠黏膜下层的实验研究

目的改进雪旺细胞(Schwann cells,SCs)原代培养方法,以获得大量高纯度SCs;研究猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)与SCs的生物相容性;通过复合SCs,使SIS负载NGF。方法取2～3日龄SD乳鼠双侧坐骨神经,以胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶分步消化,差速贴壁20 min,G418处理48 h,含2.5%FBS的H-DMEM培养基培养;MTT法检测SCs增殖情况,抗S-100免疫荧光染色检测SCs纯度。将第3代SCs和SIS复合培养,行HE染色和扫描电镜观察两者复合生长情况,复合培养1、2、3、4、5、7 d ELISA法检测培养上清中NGF含量。复合培养3、5、7、10、13、15 d后反复冻融脱细胞处理,ELISA法检测脱细胞后SIS中NGF含量。结果纯化后的SCs纯度达98%以上;MTT检测示SCs传代后3 d进入对数生长期,7 d后进入平台期。HE染色和扫描电镜观察均显示SCs在SIS上黏附良好,细胞形态呈纺锤形,有明显突起,分泌较多细胞外基质。ELISA检测发现SCs与SIS复合培养后,培养上清中的NGF含量随时间延长而逐渐升高,与同时间点对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。通过与SCs复合后反复冻融脱细胞,SIS中NGF含量在培养10 d达峰值(414.29±20.87)pg/cm2,显著高于未复合细胞的单纯SIS材料中NGF含量(4.92±2.06)pg/cm2,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论联合双酶消化、差速贴壁、G418处理、低浓度酶消化和低浓度血清培养,可在较短时间内获得大量高纯度SCs。SCs与SIS复合生长相容性好,不影响SCs的NGF分泌。通过与SCs的复合、反复冻融脱细胞后,SIS中负载了大量NGF,有望成为良好的神经修复材料。