基于循证医学方法对国内外动物实验伦理培训方法的分析与总结

目的总结国内外动物实验伦理培训的方法与经验,分析目前伦理培训面临的机遇和问题,探索适合我国动物实验研究现况的相关医学研究人员的伦理培训方法。方法在PubMed、Embase、中国知网和万方数据库检索2012年1月-2022年2月与动物实验伦理培训相关的文献,由2名研究者独立筛选文献、提取资料后进行分析。结果经过筛选共纳入44篇文献,其中中文文献19篇、英文文献25篇,涉及44个机构。通过对文献的分析可知,美英等发达国家涉及实验动物福利和伦理的法律相对完善,如美国的《动物福利法》、英国的《动物(科学程序)法案》、德国的《动物福利法》、日本的《动物福利和管理法》等,而国内则以行政法规为主,大多以管理条例进行约束;国内外均有部分机构参与动物实验的人员存在伦理意识参差不齐的现象;国内部分机构的培训时间比国外少;国内培训方法及内容有待完善。基于上述结果,结合实际经验,四川大学华西医院对原有的动物实验伦理培训体系进行了完善。结论国内各单位需要改进动物实验伦理培训方法,更加系统、科学地提高各阶段参与动物实验人员的意识与认知,并且加强伦理审查。

心脏磁共振组织追踪2D与3D应变评估实验性自身免疫性心肌炎模型大鼠的诊断价值及可重复性研究

目的探讨心脏磁共振组织追踪(cardiac magnetic resonance tissue tracking, CMR-TT)二维(two-dimensional, 2D)与三维(three-dimensional, 3D)应变对实验性自身免疫性心肌炎大鼠的诊断价值及其可重复性。方法将20只Lewis大鼠随机等分为模型组和对照组,大鼠足垫皮下注射猪心肌肌凝蛋白以制备自身免疫性心肌炎动物模型,在初次注射后第35天进行7.0T CMR电影序列扫描,心脏专用后处理软件分析左心室心功能及整体应变。磁共振扫描完成后处死大鼠,取心肌组织行HE和Masson染色,以病理结果为金标准,通过受试者工作特性(ROC)曲线评价各应变参数的诊断价值,各应变值的重复性检验采用组内相关系数(ICC)、变异系数(CV)、Bland-Altman图分析。结果病理学发现对照组心肌细胞形态结构未见明显异常改变,模型组所有大鼠均感染心肌炎,表现为心肌纤维排列紊乱、变性、坏死、炎细胞浸润、间质纤维化,造模成功。ROC曲线显示2D应变参数诊断心肌炎的价值高于3D应变参数,2D整体环向应变(global circumferential strain, GCS)、2D整体径向应变(global radial strain, GRS)、2D整体纵向应变(global longitudinal strain, GLS)、3D GLS、3D GCS、3D GRS的曲线下面积(AUC)分别为0.96、0.95、0.90、0.87、0.85、0.77;观察者内和观察者间3D应变重复性(ICC在0.421~0.79)均低于2D应变(ICC在0.893~0.986)。结论 CMR-TT 2D应变参数在心肌炎诊断价值以及心肌形变分析中的可行性、可重复性方面均优于3D应变参数。

兔糖尿病周围神经病变模型的建立及超声表现

目的探讨兔糖尿病周围神经病变模型的建立方法,并评价超声在兔糖尿病周围神经病变模型中的应用价值。方法将30只雄性新西兰兔随机分为正常对照组(N组,n=6)和造模组(n=24)。造模组按体重65 mg/kg耳缘静脉注射新鲜配制的5%四氧嘧啶,维持其血糖浓度大于16.0 mmol/L 1周以上,随机等分为糖尿病病程1月组(A组)、2月组(B组)和3月组(C组)。N组注射等量生理盐水。分别于1、2、3个月后,利用超声测量A、B、C及N组兔的坐骨神经横截面面积,分析坐骨神经病变前后的超声表现。记录各组兔坐骨神经的神经传导速度,检测后分批取材行病理染色,观察其病理结构的改变。结果造模组24只四氧嘧啶诱导的兔糖尿病模型中2只死亡,1只血糖低于16.0 mmol/L,其余21只成功建立糖尿病模型,成功率为87.5%。超声测得A、B、C组神经横截面面积平均值分别为(2.30±0.13)、(2.90±0.17)、(3.86±0.47)mm^(2),其中B组、C组显著大于N组的(2.03±0.26)mm^(2)(P<0.01)。在四氧嘧啶诱导3个月后,兔坐骨神经传导速度减低,传导速度为(51.14±0.45)m/s,与N组比较差异有统计学意义(P<0.05);A、B与N组比较,动作电位传导速度差异均无统计学意义(P<0.05)。结论低剂量四氧嘧啶诱导兔糖尿病3个月后,坐骨神经出现神经传导速度降低,成功建立糖尿病周围神经病变模型,且造模成功率较高,死亡率低。超声成像可以定量评估兔糖尿病模型坐骨神经的形态变化,可能对糖尿病周围神经病变的诊断具有重要意义。

骨组织工程领域基于水凝胶的血管化策略

骨组织再生与血管形成密不可分,如何实现骨替代材料的血管化是目前骨组织工程领域迫切需要解决的问题。骨的生长发育、矿化成熟、改造塑型和组织再生都基于优异的血管化网络形成。近年来,越来越多的研究者通过水凝胶搭载不同细胞、细胞因子、金属离子、小分子物质进行体外血管化构建并应用于骨再生之中。在此背景之下,该文对骨组织工程领域基于水凝胶的血管化策略进行综述。

无机生物材料在骨修复中的骨免疫调节作用

目的 综述无机生物材料在骨修复过程中的骨免疫调节作用以及相关作用机制。方法 广泛查阅国内外相关文献,总结各类无机生物材料在骨修复过程中的作用特点,探讨其在该过程中的骨免疫作用机制。结果 免疫细胞在骨组织动态平衡中扮演重要角色。无机生物材料通过改变自身表面粗糙度、表面润湿性等理化特性可以直接调控机体内的免疫细胞,构建适宜的免疫微环境,进而实现对成骨过程的动态调控。结论 无机生物材料是一类广泛应用于骨修复的生物材料,充分认识材料在骨修复过程中的骨免疫调节作用,有助于设计新型骨免疫调节支架用于骨修复。

胎羊宫内心脏介入手术中孕羊麻醉方案研究

目的探讨不同4.0%水合氯醛给药方式的孕羊麻醉方案,在胎羊宫内心脏介入手术中的效果,旨在为胎儿宫内心脏介入手术麻醉方案提供依据。方法将40只孕龄为110~127d的孕羊,按照随机数字表法,将其随机分为滴注组（4.0%水合氯醛持续静脉滴注）及推注组（4.0%水合氯醛负荷给药后间断静脉推注）,每组20只孕羊。观察两组实验孕羊的麻醉显效、复苏时间及麻醉状态能否满足手术要求,记录镇静剂总量,检测术前及术后2个时间点孕羊心率、平均动脉压（MAP）、血pH值、动脉血氧分压（PaO2）、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）、血糖、血乳酸、肾上腺素、去甲肾上腺素及皮质醇10项指标水平变化。比较两组孕羊麻醉效果差异,以及在不同组别及不同时间点上述10项指标的水平差异。两组孕羊体质量及孕龄比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结果 1两组孕羊麻醉方案比较,术前肌内注射给药、麻醉给药途径、麻醉维持时间及呼吸道控制情况等方面均相同,两组孕羊麻醉方案均能满足胎羊宫内心脏介入手术要求,但滴注组对麻醉深浅的控制稍难。两组孕羊麻醉最快显效时间及术后开始复苏时间比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。滴注组氯胺酮剂量小于推注组[（116.3±22.5）mg vs（209.3±20.8）mg],而4.0%水合氯醛及地西泮剂量则大于推注组[（216.7±39.7）mL vs（165.4±19.5）mL,（19.2±3.4）mg vs（10.1±2.9）mg],孕羊术后完全复苏时间长于推注组[（273.5±26.2）min vs（191.9±33.1）min],且差异均有统计学意义（P〈0.05）。2术前两组孕羊上述10项指标水平比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。滴注组孕羊术后血乳酸、肾上腺素、去甲肾上腺素及皮质醇含量较术前增高[分别为（6.0±0.8）mmol/L vs（3.7±0.6）mmol/L,（626.3±99.4）ng/L vs（167.3±35.4）ng/L,（6 631.9±753.2）ng/L vs（1 938.5±393.3）ng/L,（509.0±133.6）ng/L vs（219.9±33.3）ng/L];推注组孕羊术后该4项指标含量较术前增高[分别为（5.0±0.6）mmol/L vs（3.2±0.8）mmol/L,（336.5±58.6）ng/L vs（189.6±32.4）ng/L,（4 063.5±834.7）ng/L vs（2 133.8±323.7）ng/L,（305.9±64.7）ng/L vs（187.3±31.5）ng/L];术后该4项指标在滴注组均较推注组高[分别为（6.0±0.8）mmol/L vs（5.0±0.6）mmol/L,（626.3±99.4）ng/L vs（336.5±58.6）ng/L,（6 631.9±753.2）ng/L vs（4 063.5±834.7）ng/L,（509.0±133.6）ng/L vs（305.9±64.7）ng/L],两组上述指标比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。而孕羊心率、MAP、血pH值及PaO2在不同组别或同组内的不同时间点（术前或术后）比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论胎羊宫内心脏介入手术中,4.0%水合氯醛间断推注给药联合使用氯胺酮及地西泮的孕羊麻醉方案,因4.0%水合氯醛及地西泮剂量较小,具有安全性更高、更易于掌握的特点。

金黄色葡萄球菌FnbpA免疫优势片段的构建及免疫保护性研究

目的构建金黄色葡萄球菌FnbpA蛋白免疫优势片段原核表达菌株并研究其重组蛋白免疫原性。方法根据预测确定N区优势片段,通过聚合酶链反应(PCR)法对目的片段进行基因扩增,转入表达载体pET-32a,并导入宿主菌大肠杆菌(E.coli)Rosstta中进行原核表达;将N区优势片段与重复区优势片段通过重叠延伸聚合酶链反应(overlap PCR)融合,原核表达;将蛋白FL纯化,分别免疫Balb/c小鼠,并检测小鼠IgG水平、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、免疫保护率。结果各重组蛋白在E.coli Rosstta中均获得表达,表达后FnbpA 301-430aa、FL蛋白大小分别约39.3×103,49.1×103;抗体水平检测结果表明重组蛋白FL抗体水平接近全蛋白FnbpA,高于FnbpA 301-430aa;重组FL组淋巴细胞分泌IL-4、IFN-γ、IL-17的能力与FnbpA 301-430aa比较差异有统计学意义(P<0.05);攻毒结果表明,全蛋白FnbpA实验组免疫保护性最好,FL实验组保护性效果优于FnbpA 301-430aa。结论成功构建了金黄色葡萄球菌FnbpA免疫优势截短体蛋白的原核表达菌株,重组蛋白FL具有良好的免疫保护性。

金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A r10-11截短体蛋白基因片段的原核表达与免疫原性

目的构建金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(fibronectin binding protein A,FnBPA)r10-11截短体融合蛋白的原核表达菌株并研究其免疫原性。方法采用重组聚合酶链反应(ploymerase chain reaction,PCR)技术从金黄色葡萄球菌Newman株全基因组序列中进行PCR扩增,对扩增产物进行纯化,连接T载体后转入大肠杆菌DH5α中进行克隆,提取重组后的质粒进行双酶切鉴定,并回收目的片段连接到pET-32a质粒中,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,采用HIS蛋白纯化柱纯化截短蛋白FnBPAr10-11,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定,纯化后的FnBPAr10-11用于免疫小鼠[分为无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)组、FnBPA组、FnBPAr10-11组],检测小鼠血清免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)水平、细胞因子水平、免疫保护率。结果 SDS-PAGE分析显示,表达后的蛋白相对分子质量约为33.1×103。FnBPAr10-11组与FnBPA组IgG抗体效价达1∶128 000,与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。FnBPAr10-11组的细胞因子水平与FnBPA组比较差异无统计学意义(P>0.05),与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01)。攻毒试验中FnBPAr10-11组的免疫保护作用在50%以上。结论成功构建了金黄色葡萄球菌Fn BPAr10-11截短体融合蛋白的原核表达菌株,该截短蛋白免疫原性良好。

Red重组介导大肠杆菌外膜蛋白A缺失突变菌株的构建及生物学特性初步研究

目的利用Red同源重组的方法构建大肠杆菌外膜蛋白A(outer membrane protein-A,Omp A)基因缺失株,为后续研究奠定一定的基础。方法以已知大肠杆菌Omp A为靶点在其两端设计同源臂引物,以质粒p KD3为模板利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出氯霉素筛选标记序列,然后采用Red重组技术利用质粒p KD46诱导表达的重组酶通过电击的方法把外源构建打靶片段导入大肠杆菌,构建大肠杆菌Omp A基因缺失突变株。以菌落PCR方法检测基因大小,以蛋白质印迹法检测蛋白表达情况,以重组菌株培养过程的吸光度(A600)值来反映重组子的生长情况。结果成功构建了大肠杆菌Omp A基因缺失突变株,通过蛋白质印迹法检测和细菌生长曲线测定,发现Omp A基因成功完全丢失,突变株的生长曲线与野生型的差异不显著。结论Omp A基因缺失对大肠杆菌的生长无显著影响,为进一步研究疫苗活载体提供了一定基础。